lncRNA ADPGK-AS1通過調(diào)控miR-217表達對非小細胞肺癌細胞增殖和凋亡的影響

肖欽曉 程宏寧 顏洪順 王春剛 陸小珠

肺癌是全球最常見的癌癥，每年約有160萬人死于肺癌，肺癌患者大約有85%的組織亞型是非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[1]。NSCLC亞型患者通常存在不同的驅(qū)動基因突變，這些突變?yōu)镹SCLC的精確亞分類和患者的靶向治療和免疫治療提供了新的方向和進展[2]。研究抑制NSCLC的分子機制，尋找潛在的個性化精準治療靶點，已成為NSCLC基礎(chǔ)研究領(lǐng)域的熱點。

大量研究表明，長鏈非編碼(long non-coding RNA，lncRNA)可以通過多種機制調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯和蛋白質(zhì)功能，在NSCLC的診斷和預后中是很有前途的生物標志物，可能是其治療靶點，并與癌細胞的耐藥性和轉(zhuǎn)移等有關(guān)[3-5]。研究表明，lncRNA ADP依賴的葡萄糖激酶反義RNA 1(ADP dependent glucokinase antisense RNA 1，ADPGK-AS1)在乳腺癌[6]、胃癌[7]、胰腺癌[8]組織和細胞中表達上調(diào)，與癌細胞的增殖、遷移和凋亡等有關(guān)，但其在NSCLC中的作用尚不清楚。本研究通過LncBase預測發(fā)現(xiàn)，miR-217可能是ADPGK-AS1的靶基因。miR-217在肺癌組織中低表達，過表達miR-217抑制肺癌細胞的增殖、遷移和侵襲，誘導細胞凋亡[9]。miR-217和lncRNA ADPGK-AS1在NSCLC中是否存在某種調(diào)控關(guān)系，尚不清楚。本課題以NSCLC A549細胞為主要研究對象，研究lncRNA ADPGK-AS1和miR-217對A549增殖、凋亡的影響及潛在分子機制。

資料與方法

一、材料

選取2016年2月至2019年3月于本院病理檢查確診為NSCLC的患者，取患者病理診斷的腫瘤組織和癌旁組織116例，男77例，女39例，年齡范圍28～79(53.02±14.53)歲，鱗癌41例，腺癌54例，其他21例。NSCLC診斷標準參照《NCCN臨床實踐指南：非小細胞肺癌》。

人非小細胞肺癌細胞株A549(購自ATCC)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)(購自美國Hyclone公司)，F(xiàn)12K培養(yǎng)基、胰蛋白酶、噻唑藍(Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide,MTT)和二甲基亞砜(Dimethyl sulfoxide,DMSO)(購自美國Sigma-Aldrich公司)；TRIzol試劑、Real-time PCR 試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒(RT-PCR)(購自寶生物工程(大連)有限公司)；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒(購自美國Invitrogen公司)；雙熒光素酶報告系統(tǒng)(Dual-Luciferase Reporter Assay System)(購自美國Promega公司)；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒(購自上海碧云天生物科技有限公司)；lncRNA ADPGK-AS1 抑制劑(si-ADPGK-AS1)、lncRNA ADPGK-AS1過表達載體(pcDNA-ADPGK-AS1)、miR-217模擬物(miR-217)、miR-217干擾劑(anti-miR-217)、陰性對照(si-NC、miR-NC、pcDNA、anti-miR-NC)、ADPGK-AS1野生型和突變型雙熒光素酶報告載體均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；CyclinD1抗體、p21抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體(購自美國Santa cruze公司)；流式細胞儀(購自美國BD公司)，Real-time PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)。

二、 方法

1 細胞培養(yǎng) 配制含10 % FBS的F12K培養(yǎng)液，將A549細胞培養(yǎng)在添加1%青-鏈霉素的F12K培養(yǎng)液中，置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，濕度95%。待細胞生長至對數(shù)生長期時，洗滌消化，1 ∶3傳代。

2 Real-time PCR檢測lncRNA ADPGK-AS1和miR-217的表達 收集NSCLC組織、癌旁組織樣本及各組轉(zhuǎn)染后的A549細胞，提取組織樣本和細胞總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后以cDNA為模板進行Real-time PCR反應合成lncRNA ADPGK-AS1和miR-217。引 物 如 下：miR-217 上 游： 5′-CGCTCTACTGCATCAGGAACTGA-3′，下游： 5′-GTGCAGGGTCCGAGGT-3′；ADPGK-AS1上游：5′-GCCGATGTCGACACAAGCG-3′，下游： 5′-AGCAAATGTGTTCCCATCCCT-3′。用2-ΔΔCt方法進行數(shù)據(jù)分析。

3 細胞轉(zhuǎn)染 將對數(shù)生長期的A549細胞以2×105個細胞//孔接種于6孔板中，細胞培養(yǎng)至融合為一層時進行轉(zhuǎn)染。用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒將各組細胞轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)好的A549細胞中，培養(yǎng)6h，換成完全培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48h，收集轉(zhuǎn)染的A549細胞，檢測細胞中miR-217和lncRNA ADPGK-AS1的含量，驗證轉(zhuǎn)染效果。轉(zhuǎn)染分組：雙熒光素酶報告系統(tǒng)組：分別轉(zhuǎn)染miR-NC+WT-ADPGK-AS1，miR-217+WT-ADPGK-AS1，miR-NC+MUT-ADPGK-AS1，miR-217+MUT-ADPGK-AS1；lncRNA ADPGK-AS1過表達組：轉(zhuǎn)染pcDNA-ADPGK-AS1，以轉(zhuǎn)染pcDNA為對照；lncRNA ADPGK-AS1抑制組：轉(zhuǎn)染si-ADPGK-AS1，以轉(zhuǎn)染si-NC為對照；miR-217過表達組：轉(zhuǎn)染miR-217，以轉(zhuǎn)染miR-NC為對照；lncRNA ADPGK-AS1和miR-217雙抑制組：轉(zhuǎn)染si-ADPGK-AS1+anti-miR-217，以轉(zhuǎn)染si-ADPGK-AS1+anti-miR-NC為對照。

4 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗 通過LncBase Predicted v.2預測lncRNA ADPGK-AS1與miR-217的結(jié)合位點，構(gòu)建含結(jié)合位點的lncRNA ADPGK-AS1的野生型(WT-ADPGK-AS1)和突變型(MUT-ADPGK-AS1)雙熒光素酶報告載體。根據(jù)1.2.3進行A549細胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，將構(gòu)建的雙熒光素酶報告載體分別與miR-NC或miR-217共轉(zhuǎn)染A549細胞，轉(zhuǎn)染48h，收集細胞，裂解細胞，離心收集上清，以海腎熒光素酶活性為內(nèi)參照，檢測上清中相對螢火蟲熒光素酶活性。

5 MTT實驗測定細胞活性 收集轉(zhuǎn)染后的A549細胞，以2×103個細胞/孔接種于96微孔板中，置培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別在24h、48h、72h時進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μL(5 mg/mL)MTT，培養(yǎng)4h，棄上清，加入DMSO150 μL /孔，室溫振蕩10 min，酶標儀測定490 nm吸光度值。

6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 將轉(zhuǎn)染后的A549細胞接種于6孔板中，繼續(xù)培養(yǎng)48h，收集細胞至離心管中，洗滌并進行胰酶消化，然后離心棄上清，加入195μLAnnexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，然后加入5μL Annexin V-FITC和 10μL碘化丙啶(propidium iodide,PI)，混勻后室溫避光20 min，上流式細胞儀檢測凋亡率。

7 Western blot檢測Cyclin D1、p21、Bcl-2和Bax蛋白表達 收集lncRNA ADPGK-AS1抑制組、miR-217過表達組和lncRNA ADPGK-AS1和miR-217雙抑制組培養(yǎng)48h的A549細胞，破碎細胞，收集細胞總蛋白，進行SDS-PAGE，然后轉(zhuǎn)PVDF膜，將膜在室溫條件下封閉2h，洗滌2次，加入稀釋的一抗(Cyclin D1抗體 1 ∶2000，p21 抗體1 ∶2000，Bcl-2抗體 1 ∶1000，Bax抗體1 ∶1000)，4℃過夜孵育，洗膜后加入稀釋的酶標二抗，室溫孵育1h，顯影，拍照，以GAPDH為內(nèi)參，檢測蛋白灰度。

三、統(tǒng)計學處理

結(jié) 果

一、lncRNA ADPGK-AS1和miR-217在非小細胞肺癌組織中的表達

與癌旁組織相比，在116例非小細胞肺癌組織中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1的含量顯著升高(P<0.05)，miR-217的含量顯著下降(P<0.05)(見表1)。

表1 lncRNA ADPGK-AS1和miR-217在非小細胞肺癌組織中的表達

注：與癌旁組織組比較，*P<0.05

二、lncRNA ADPGK-AS1靶向調(diào)控miR-217的表達

LncBase Predicted v.2預測發(fā)現(xiàn)，lncRNA ADPGK-AS1的序列中含有與miR-217互補的位點，見圖4。雙熒光素酶報告實驗結(jié)果顯示，過表達miR-217組野生型WT-ADPGK-AS1的螢火蟲熒光素酶相對活性與miR-NC對照組顯著下降(P<0.05)，而突變型MUT-ADPGK-AS1的熒光素酶相對活性無明顯變化(見表2)。qRT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達ADPGK-AS1可顯著下調(diào)miR-217 含量(P<0.05)；干擾ADPGK-AS1表達顯著上調(diào)miR-217表達量(P<0.05)(見表3)。說明lncRNA ADPGK-AS1靶向負調(diào)控miR-217的表達。

圖1 ADPGK-AS1的序列中含有與miR-217互補的核苷酸序列

表2 雙熒光素酶報告實驗

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

表3 lncRNA ADPGK-AS1調(diào)控

注：與pcDNA組比較，*P<0.05；與si-NC組比較，#P<0.05

三、抑制lncRNA ADPGK-AS1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

抑制ADPGK-AS1表達后A549細胞中l(wèi)ncRNA ADPGK-AS1含量顯著下降，細胞OD490 nm在24h、48h和72h均顯著下降，細胞凋亡率升高，CyclinD1和Bcl-2表達降低，p21和Bax蛋白表達升高，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)見(圖2、表4)。說明抑制ADPGK-AS1表達可以抑制非小細胞肺癌A549細胞增殖并促進細胞凋亡。

四、miR-217過表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

miR-217過表達后，A549細胞OD490 nm在24h、48h和72h均顯著下降，細胞凋亡率升高，CyclinD1和Bcl-2表達降低，p21和Bax蛋白表達升高，均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)見(圖3、表5)。說明過表達miR-217可抑制A549增殖并誘導細胞凋亡。

圖2 抑制lncRNA ADPGK-AS1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響A:增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖

圖3 miR-217過表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響A:增殖和凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖

表4 抑制lncRNA ADPGK-AS1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

注：與si-NC組比較，*P<0.05

五、干擾miR-217表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ADPGK-AS1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用

為確認lncRNA ADPGK-AS1通過調(diào)控miR-217發(fā)揮對A549細胞的增殖和凋亡的影響作用，在抑制lncRNA ADPGK-AS1的同時干擾miR-217轉(zhuǎn)錄。結(jié)果表明，抑制ADPGK-AS1同時干擾miR-217轉(zhuǎn)錄后A549細胞中miR-217 水平下降，細胞在24h、48h和72h時細胞OD490nm顯著升高，細胞凋亡率降低，CyclinD1和Bcl-2含量升高，p21和Bax含量降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)，見(圖4和表6)。說明干擾miR-217表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ADPGK-AS1對A549細胞增殖、凋亡的作用。

討 論

肺癌是世界第一大癌癥，患者的5年生存率根據(jù)階段和地區(qū)的不同從4-17%不等，因為肺癌的亞型不同，靶向治療也越來越多的應用于患者的個性化治療中[10]。大量研究表明，已經(jīng)確定的NSCLC危險因素可能影響lncRNA在NSCLC組織和細胞系中的表達水平，從而影響NSCLC的發(fā)生、發(fā)展等惡性表型[11]。LncRNA ADPGK-AS1又稱ADP依賴的葡萄糖激酶反義RNA 1，其在多種腫瘤組織和細胞中過表達[6-8]，下調(diào)其表達可抑制癌細胞的增殖和遷移，并促進細胞凋亡。最新研究表明，lncRNA ADPGK-AS1在骨肉瘤(OS)組織和細胞中也高表達，抑制其表達可靶向miR-542-3p減少OS細胞的增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡[12]。LncRNA ADPGK-AS1在NSCLC中表達和作用尚不清楚。本研究通過檢測116例NSCLC組織和癌旁組織發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織相比，在NSCLC組織中ADPGK-AS1的含量顯著升高。本研究通過LncBase預測發(fā)現(xiàn)，ADPGK-AS1的序列中含有與miR-217互補的核苷酸序列，預示ADPGK-AS1與miR-217之間可能存在結(jié)合位點。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果表明ADPGK-AS1靶向miR-217，qRT-PCR結(jié)果表明，ADPGK-AS1負調(diào)控miR-217的轉(zhuǎn)錄，兩者的含量呈負相關(guān)。在A549細胞中抑制ADPGK-AS1表達可以降低細胞OD值、周期蛋白CyclinD1和抗凋亡蛋白Bcl-2含量，提高細胞凋亡率、周期蛋白p21和促凋亡蛋白Bax含量，抑制NSCLC A549細胞增殖，誘導A549細胞凋亡，說明lncRNA ADPGK-AS1在NSCLC細胞增殖和凋亡中發(fā)揮重要作用。

圖4 干擾miR-217逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ADPGK-AS1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用A:增殖、凋亡相關(guān)蛋白表達；B：細胞凋亡流式圖

表5 miR-217過表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響

注：與miR-NC組比較，*P<0.05

表6 干擾miR-217逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ADPGK-AS1表達對非小細胞肺癌A549細胞增殖和凋亡的作用

注：與si-NC組比較，*P<0.05；與si-ADPGK-AS1+anti-miR-NC組比較，#P<0.05

miR-217在急性髓系白血病(AML)[13]、腎癌[14]、甲狀腺癌[15]、肝細胞癌[16]等腫瘤中表達顯著下調(diào)，參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲遷移等生物學過程，也參與慢性心力衰竭(CHF)[17]的調(diào)控過程。miR-217在NSCLC細胞株中表達下調(diào)，是lncRNA HOTAIR的靶基因，miR-217的過度表達可明顯抑制H1299和A549細胞的增殖、遷移和侵襲[18]。還有研究發(fā)現(xiàn)，miR-217在肺腺癌(LUAD)組織和細胞中表達下調(diào)，通過LINC01614/miR-217/FOXP1信號通路參與LUAD的發(fā)生和發(fā)展[19]，miR-217也與肺癌對順鉑的耐藥性有關(guān)[9]。本研究結(jié)果表明，miR-217在NSCLC組織中含量下降，過表達miR-217可降低NSCLC細胞A549的增殖OD值、CyclinD1和Bcl-2蛋白含量，提高細胞凋亡率、p21和Bax蛋白含量，與前述研究結(jié)論[18]基本一致。

同時抑制兩者轉(zhuǎn)錄的研究發(fā)現(xiàn)，干擾miR-217表達逆轉(zhuǎn)了抑制lncRNA ADPGK-AS1對A549細胞增殖、凋亡的作用，驗證了兩者在NSCLC細胞A549中具有調(diào)控關(guān)系。

綜上，本研究闡述了在NSCLC組織中，lncRNA ADPGK-AS1上調(diào)，miR-217下調(diào)；lncRNA ADPGK-AS1在NSCLC細胞A549中靶向miR-217調(diào)控A549細胞增殖和凋亡，lncRNA ADPGK-AS1和miR-217可能是NSCLC的潛在分子靶點，對NSCLC的臨床靶向治療提供了新的思路。