水蚤分子生態(tài)毒理學(xué)研究進(jìn)展

鞏寧，孟紫強(qiáng)，邵魁雙，孫野青

1. 大連海事大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境系統(tǒng)生物學(xué)研究所，大連 116024 2. 山西大學(xué)環(huán)境科學(xué)研究所，山西大學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)與毒理學(xué)研究所，太原 030006 3. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，大連 116023

分子生態(tài)毒理學(xué)是采用現(xiàn)代分子生物學(xué)方法與技術(shù)研究環(huán)境化學(xué)污染物及其代謝產(chǎn)物與生物大分子(包括核酸、酶和蛋白質(zhì))相互作用的一門學(xué)科，其目的是找出污染物作用的靶位或靶分子并揭示其作用機(jī)理，從而對其在個(gè)體、種群或生態(tài)系統(tǒng)水平上的影響作出預(yù)報(bào)。近年來，隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們逐漸認(rèn)識到由毒物所導(dǎo)致的生物個(gè)體表型變化通常是由于基因表達(dá)網(wǎng)絡(luò)、多個(gè)細(xì)胞生物效應(yīng)的綜合結(jié)果，并非單一基因功能的改變所致。因此，一種或多種組學(xué)技術(shù)(包括基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、代謝組學(xué)和表觀遺傳組學(xué)等)被引入生態(tài)毒理學(xué)研究中，發(fā)展成為“分子生態(tài)毒理學(xué)”，即通過對一整套基因或蛋白質(zhì)表達(dá)的研究來探討污染物的生態(tài)毒性作用，進(jìn)而為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估服務(wù)[1]。

水蚤(water flea)是隸屬于節(jié)肢動(dòng)物門甲殼綱的浮游動(dòng)物。其中，枝角目水蚤是一類小型低等甲殼動(dòng)物，通稱水溞或溞類，俗稱紅蟲。它們廣泛分布在從極地到溫帶以及高山水體中，是初級生產(chǎn)者和高營養(yǎng)級消費(fèi)者之間的重要中間紐帶，在水生生態(tài)系統(tǒng)中具有重要地位。由于溞類對污染物敏感，所以在各種環(huán)境壓力下，表現(xiàn)出生殖力下降、活動(dòng)抑制等行為異常，這也使其成為水生毒理學(xué)研究中常用的模式生物。世界經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)據(jù)此建立起針對溞類的標(biāo)準(zhǔn)毒性測試方法(OECD Test Guideline 202, 211)[2-3]，該方法已廣泛應(yīng)用于一些重要物種的毒理學(xué)測試，例如，大型蚤[4](Daphniamagna)，中文名又稱“大型溞”；蚤狀蚤[5](D.pulex)，中文名又稱“蚤狀溞”和長刺蚤[6](D.longispina)，中文名又稱“長刺溞”。近年來，溞類生態(tài)學(xué)、毒理學(xué)和生理學(xué)平臺的建立，特別是基因組序列的獲得(http://wfleabase.org/)使得研究者們可以通過遺傳學(xué)研究工具，如基因連鎖圖譜、cDNA文庫、微陣列、轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)和代謝組學(xué)分析技術(shù)，對溞類生態(tài)毒理學(xué)效應(yīng)進(jìn)行分析[7-9]。

除了枝角目水蚤，甲殼綱其他種屬的水生生物(包括淡水種和海水種)也在水生生態(tài)毒理學(xué)研究中廣泛應(yīng)用，如橈足亞綱哲水蚤目的太平洋真寬水蚤(Eurytemorapacifica)[10]和飛馬哲水蚤(Calanusfinmarchicus)[11]，猛水蚤目的日本虎斑猛水蚤(Tigriopusjaponicus)[12]等。本文以枝角目水溞為主要綜述對象，對其他種類的水蚤也略有涉及。為敘述方便，下文統(tǒng)稱其為水蚤。

本文從分子生態(tài)毒理學(xué)角度，綜述了近年來以水蚤作為受試生物的毒理學(xué)研究進(jìn)展。生態(tài)毒理基因組學(xué)方法的應(yīng)用，使我們能夠?qū)ふ矣泻Ρ硇徒Y(jié)局與特定基因功能之間的聯(lián)系以探討水生生態(tài)毒理學(xué)作用機(jī)制，并試圖開發(fā)出有效的生物(生態(tài))標(biāo)志物。

1 基因組學(xué)研究(Genomics research)

DNA微陣列(DNA microarray)又稱DNA陣列或DNA芯片，是一塊在數(shù)平方厘米面積上安裝數(shù)千或數(shù)萬個(gè)核酸探針涂層的特殊玻璃片。經(jīng)由一次測驗(yàn)，即可提供大量基因序列相關(guān)信息，是基因組學(xué)和遺傳學(xué)研究的重要工具。目前，已有多個(gè)物種的商業(yè)化芯片用于水生毒理學(xué)研究[13-15]。由于全基因組序列的獲得，大型溞和蚤狀溞作為受試物種在多種污染物暴露下得到了廣泛的研究。

1.1 金屬及金屬納米材料

在金屬生態(tài)毒理學(xué)研究方面，Poynton等[16]采用商業(yè)化的cDNA芯片進(jìn)行研究，在亞致死暴露濃度下，鑒定了銅(Cu)、鎘(Cd)和鋅(Zn) 3種金屬的基因表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)不同金屬對大型溞的暴露可引起不同的表達(dá)模式，金屬Zn對幾丁質(zhì)酶的活性產(chǎn)生了抑制，從中鑒定出金屬硫蛋白和鐵蛋白可作為備選生物標(biāo)志物。這項(xiàng)研究為生態(tài)毒理基因組學(xué)的實(shí)用性提供了實(shí)驗(yàn)支持。同時(shí)，Poynton等[17]還將實(shí)驗(yàn)室暴露獲得的表達(dá)譜數(shù)據(jù)用于野外樣品重金屬污染的預(yù)測。利用上述cDNA芯片，將野外樣本的基因表達(dá)譜與之前建立的Cu、Cd和Zn的表達(dá)譜進(jìn)行了比較，發(fā)現(xiàn)來自含Cu的野外樣品的表達(dá)譜與實(shí)驗(yàn)室暴露的Cu的特異性基因表達(dá)譜聚類，野外樣品的表達(dá)譜中包括了之前鑒定為Cu生物標(biāo)志物的基因，證明基因表達(dá)分析可以用來預(yù)測特定的環(huán)境污染物。此外，他們的研究還表明，含有不可檢測水平的Cu的野外樣品僅導(dǎo)致少數(shù)基因的差異表達(dá)，從而在轉(zhuǎn)錄效應(yīng)上提出了無觀察毒性效應(yīng)水平(NOTEL)的概念。該作者認(rèn)為，這一概念可在區(qū)分污染區(qū)和非污染區(qū)方面發(fā)揮重要作用。在金屬納米材料方面，大型溞被分別暴露于納米銀(AgNPs)和硝酸銀(AgNO3)中，通過15k寡核苷酸芯片分析，發(fā)現(xiàn)二者表現(xiàn)出不同的表達(dá)模式。AgNPs影響水蚤蛋白代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，而AgNO3則導(dǎo)致發(fā)育過程的下調(diào)，特別是抑制了與感覺發(fā)育過程相關(guān)基因的表達(dá)，說明二者具有不同的作用靶點(diǎn)和毒性作用機(jī)制。Poynton等[18]還開發(fā)了2種特異性生物標(biāo)志物用于AgNPs的環(huán)境檢測。

1.2 農(nóng)藥、殺菌劑和藥物

基于抑制差減雜交-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(suppression subtractive hybridization-polymerase chain reaction, SSH-PCR)技術(shù)，Soetaert等[19]開發(fā)了大型溞的第一代cDNA芯片(包含855個(gè)生活周期特異性cDNAs)，成功地用于對農(nóng)藥丙環(huán)唑(propiconazole)毒性作用機(jī)制的研究。大型溞經(jīng)過1 μg·mL-1丙環(huán)唑暴露4 d后，其卵黃蛋白原基因被抑制，卵母細(xì)胞的成熟受到了影響。因而可知，卵黃蛋白原mRNA表達(dá)水平可作為農(nóng)藥對水生無脊椎動(dòng)物慢性生殖影響的早期生物標(biāo)志物。

基于大型溞的表達(dá)序列標(biāo)簽(ESTs)數(shù)據(jù)庫，Watanabe等[20]開發(fā)了一種具有高重現(xiàn)性的寡核苷酸DNA微陣列，用于評估包括五氯苯酚和β-萘黃酮在內(nèi)的不同污染物暴露下幼溞的基因表達(dá)差異。結(jié)果表明，當(dāng)暴露于不同污染物時(shí)，幼溞表現(xiàn)出不同的轉(zhuǎn)錄模式。這種基因表達(dá)的特征模式被認(rèn)為是具有化學(xué)特異性的(chemical-specific)，因此，這種水蚤的DNA芯片可被用來進(jìn)行水環(huán)境化學(xué)污染物的分類，其作用模式也有助于人們對常見淡水生物毒性機(jī)制的探討。

布洛芬是一種非甾類抗炎藥物，研究者們利用cDNA芯片和生物表型相結(jié)合的研究方法，將布洛芬暴露下大型溞的轉(zhuǎn)錄模式與表型特征相結(jié)合，發(fā)現(xiàn)布洛芬可能在分子水平、個(gè)體水平及種群水平上影響水蚤的繁殖能力[21]。在布洛芬急性暴露條件下，水蚤多個(gè)關(guān)鍵基因發(fā)生了變化。例如，三?；视椭久?triacylglycerollipase,Lip)、白三烯B4-12-羥基脫氫酶(leukotriene B4 12-hydroxydehydrogenase,Ltb4dh)、脂肪酸結(jié)合蛋白3(fatty acid binding protein 3,FABP3)、卵黃蛋白原1(vitellogenin 1,DmagVTG1)、血紅蛋白(hemoglobin,Hb)、保幼激素酯酶(juvenile hormone esterase,JHE)、卵黃外層膜蛋白1(vitelline outer layer membrane protein 1,VMO1)和幾丁質(zhì)酶(chitinase,Cht)等基因的表達(dá)發(fā)生上調(diào)或下調(diào)的變化，表明細(xì)胞的代謝過程受到了誘導(dǎo)或抑制。其中，Lip和Ltb4dh基因與類花生酸代謝有關(guān)，在無脊椎動(dòng)物的免疫系統(tǒng)中具有關(guān)鍵作用。而FABP3基因則與水蚤內(nèi)分泌系統(tǒng)中過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)信號通路的激活有關(guān)。Cht是凋亡過程中分泌的蛻皮液(ecdysial fluid, moulting fluid)中的關(guān)鍵酶，其基因的表達(dá)與水蚤的生長發(fā)育有關(guān)；JHE、DmagVTG1和VMO1則是水蚤中與卵子發(fā)育相關(guān)的酶，它們的基因在水蚤卵子發(fā)育的不同階段被表達(dá)。這些基因表達(dá)的變化可作為布洛芬暴露的潛在生物標(biāo)志物。

1.3 環(huán)境激素類化合物

環(huán)境激素類化合物是否影響水蚤性別的分化，一直是生態(tài)毒理學(xué)家們關(guān)心的問題。眾所周知，水蚤中的2類激素(保幼激素和蛻皮激素)在水蚤的性別決定中起著關(guān)鍵作用。2002年，Olmstead和LeBlanc[22]首次報(bào)道了類倍半萜烯激素——甲基法尼酯(methyl farnesoate, MF)誘導(dǎo)雄性大型溞出現(xiàn)的作用，它是昆蟲保幼激素Ⅲ的未環(huán)化形式。除此之外，研究發(fā)現(xiàn)，其他保幼激素的類似物也有誘導(dǎo)雄性水蚤產(chǎn)生的作用，如殺蟲劑蚊蠅醚(pyriproxyfen)、苯氧威(fenoxycarb)和甲基普林(methoprene)。有趣的是，所有上述的化合物同時(shí)還誘導(dǎo)了水蚤中血紅蛋白(hemoglobin, Hb)的合成。因此，雄性產(chǎn)生與Hb誘導(dǎo)這2個(gè)過程似乎可以通過保幼激素的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相偶聯(lián)。Olmstead和LeBlanc[22]的研究還表明，在大型溞和蚤狀溞中，MF刺激雄性個(gè)體的出現(xiàn)呈現(xiàn)劑量依賴效應(yīng)，>300 nmol·L-1的MF導(dǎo)致所有水蚤均為雄性。通過基因芯片分析，Eads等[23]發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，MF處理組的水蚤有39個(gè)上調(diào)基因和16個(gè)下調(diào)基因。他們鑒定出了22個(gè)差異表達(dá)的基因。其中，神經(jīng)元乙酰膽堿受體、精氨酸激酶、淀粉酶、細(xì)胞色素c氧化酶和細(xì)胞色素b以及一些角質(zhì)蛋白、肌動(dòng)蛋白、核糖體生物合成調(diào)控蛋白等基因表達(dá)上調(diào)。

雙酚A(BPA)的生態(tài)毒理效應(yīng)近年來受到了廣泛關(guān)注。利用cDNA芯片分析方法，Jeong等[24]研究了BPA在水蚤繁殖、發(fā)育及個(gè)體行為中的影響。21 d繁殖抑制測試表明10 mg·L-1的BPA顯著影響了大型溞的繁殖能力。一些候選基因，包括角質(zhì)層蛋白、卵黃蛋白原、蛋白酶和核糖體蛋白等的表達(dá)水平有顯著變化。這些基因可能成為BPA暴露的生物標(biāo)志物。

2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究(Transcriptomics research)

隨著高通量測序(high-throughput sequencing)平臺的相繼出現(xiàn)，基于新一代測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組測序(RNA-seq)成為大規(guī)模研究轉(zhuǎn)錄組的一種新的且更為有效的方法[25]。RNA-seq是直接對cDNA序列進(jìn)行測序，產(chǎn)生數(shù)以萬計(jì)的reads數(shù)量，從而使得一段特殊的基因組區(qū)域的轉(zhuǎn)錄水平可以直接通過比對到該基因組區(qū)域的reads數(shù)來衡量。在水生分子毒理學(xué)領(lǐng)域，越來越多的研究者們利用該技術(shù)進(jìn)行污染物的毒性機(jī)制分析，試圖找到基因表達(dá)與環(huán)境變化之間的關(guān)系[26-30]。

2.1 重金屬

Orsini等[31]利用RNA-seq對包括不同濃度重金屬Cd、Pb暴露在內(nèi)的12種環(huán)境壓力下大型溞的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析。他們選擇了3個(gè)基因型的大型溞群體，其中2個(gè)為近交系，另一個(gè)為該近交系的重組體。對每一個(gè)基因型的每一種暴露均提取5個(gè)生物學(xué)重復(fù)的RNA樣本，并從這5個(gè)生物學(xué)重復(fù)中挑選3個(gè)高質(zhì)量的RNA用于后續(xù)的高通量測序，進(jìn)而獲得了多套轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。結(jié)合大型溞的參考(對照)基因組和基因圖譜，他們將獲得的大型溞環(huán)境基因組信息上傳到水蚤基因組數(shù)據(jù)庫中(wFleaBase.org)。利用該數(shù)據(jù)庫，可對差異表達(dá)的基因進(jìn)行功能注釋，進(jìn)而對環(huán)境壓力下遺傳適應(yīng)性和表型可塑性對壓力反應(yīng)的相對貢獻(xiàn)做出評估。由此可知，水蚤由于具有豐富的生態(tài)數(shù)據(jù)而成為一個(gè)很好的研究模型。

2.2 藥物

近來，Russo等[32]探討了水環(huán)境中存在的3種抗癌藥物伊馬替尼(imatinib mesylate, IMA)、順鉑(cisplatinum, CDDP)和依托泊苷(etoposide, ETP)對大型溞的影響。他們將幼溞分別暴露在能夠引起DNA損傷的低濃度藥物中(IMA: 2 000 ng·L-1, ETP: 300 ng·L-1, CDDP: 10 ng·L-1)，利用RNA-seq技術(shù)一共獲得了14 000 000個(gè)reads，發(fā)現(xiàn)3種藥物均引起了血管緊張素轉(zhuǎn)化酶樣基因(angiotensin converting enzyme-like gene,ance)的下調(diào)，而ETP還引起了DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ基因(DNA topoisomerase Ⅱ)的下調(diào)。GO(Gene Ontology)富集分析的結(jié)果表明，ETP和IMA引起的DNA損傷干擾了細(xì)胞周期調(diào)控和G-蛋白偶聯(lián)受體(G-protein coupled receptor, GPCR)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。這種失調(diào)可能會影響水蚤神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，甚至整個(gè)個(gè)體的生長和發(fā)育。這一工作的意義在于，他們以水蚤作為受試生物，探討了藥物對非靶向生物的影響，深入了解了抗癌藥物暴露引起的DNA損傷機(jī)制，并對這些化學(xué)物質(zhì)如何影響這一重要浮游動(dòng)物物種的生長和生存提出了新的假設(shè)。

2.3 有毒藻毒素

作為水生生態(tài)系統(tǒng)中的初級消費(fèi)者，水蚤等浮游動(dòng)物對控制水體中微藻的數(shù)量、抑制有害水華具有重要作用。同時(shí)，有毒藻毒素也可通過水蚤向上一營養(yǎng)級傳遞，甚至危害到人類的健康。一般來講，藻毒素不會造成浮游動(dòng)物的死亡，但是否對其基因表達(dá)乃至代謝活動(dòng)產(chǎn)生影響，進(jìn)而在種群或群落水平上產(chǎn)生毒性效應(yīng)，乃是生態(tài)毒理學(xué)家們關(guān)心的問題。RNA-Seq技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組分析已經(jīng)成為揭示浮游動(dòng)物耐受藻毒素分子機(jī)制的有利工具。為了排除攝食的影響，Schwarzenberger等[33]用分泌微囊藻毒素的藍(lán)藻及其變異的工程菌株(不分泌藻毒素)分別投喂大型溞。通過RNA-Seq技術(shù)識別出水蚤基因組中應(yīng)對微囊藻毒素脅迫的候選基因，發(fā)現(xiàn)ABC家族的一些轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可能起到了基因調(diào)控的作用。為探討貝毒的影響，Roncalli等[11]以橈足類浮游動(dòng)物飛馬哲水蚤(C.finmarchicus)為受試生物，研究了喂食不同時(shí)間的亞歷山大藻(Alexandriumfundyense)后，水蚤轉(zhuǎn)錄譜的變化，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過5 d的喂食，一些與能量代謝相關(guān)的基因表達(dá)下調(diào)，表明石房蛤毒素(saxitoxin)影響了水蚤的能量分配。與預(yù)想結(jié)果不同的是，一些與解毒相關(guān)的基因(如GSTs和CYP450)并沒有明顯的上調(diào)，而一些與消化相關(guān)的基因表達(dá)(如胰蛋白酶)卻發(fā)生了變化。同時(shí)，與生物合成、生長及繁殖相關(guān)的基因明顯下調(diào)。這些結(jié)果表明，雖然水蚤表現(xiàn)出了對亞歷山大藻極強(qiáng)的耐受性(無死亡現(xiàn)象)，但它們的生理活動(dòng)及繁殖能力已經(jīng)受到了影響。由此推測，當(dāng)亞歷山大藻赤潮爆發(fā)的時(shí)候，水蚤的種群增長可能會受到影響。

3 蛋白質(zhì)組學(xué)研究(Proteomics research)

迄今為止，蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為應(yīng)用于生態(tài)系統(tǒng)評估的組學(xué)方法中使用第二廣泛的方法[1]。與轉(zhuǎn)錄組水平上的生態(tài)毒理學(xué)研究相比，基于蛋白質(zhì)組分析的研究更偏重于指紋圖譜(即蛋白表達(dá)譜)的識別。這項(xiàng)研究通?；?種主要的技術(shù)。一是基于SELDI質(zhì)譜(也被稱為retentate chromatography-mass spectrometry, RC-MS)的蛋白質(zhì)指紋識別方法，二是基于雙向電泳(2-DE)和MALDI-MS(matrix-assisted laser deionization)的肽段指紋識別。例如，Le等[34]利用2-DE技術(shù)研究了單一或復(fù)合重金屬(三價(jià)砷、五價(jià)砷和鎘)污染對大型溞的影響。他們鑒定出了117個(gè)發(fā)生變化的蛋白，可用于作為水生態(tài)系統(tǒng)重金屬污染的蛋白標(biāo)志物。與單一金屬作用的蛋白表達(dá)模式相比，2種重金屬混合物的暴露表現(xiàn)出了復(fù)雜的分子間相互作用，其蛋白表達(dá)模式并不是2種單一金屬的模式迭加。將大型溞暴露于檸檬酸鹽包被的納米銀和硝酸銀溶液中，對其個(gè)體水平的毒性效應(yīng)及分子機(jī)制進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)2組的卵黃蛋白原水平均有上升，但納米銀暴露組的血紅蛋白水平升高，而硝酸銀暴露組的調(diào)控蛋白的羰基化水平降低，表明2種銀暴露對水蚤的生物途徑有明顯影響，從而可能導(dǎo)致大型溞與水環(huán)境化學(xué)污染物發(fā)生不同的相互作用[35]。這一結(jié)果與前述在轉(zhuǎn)錄組水平的研究均說明納米顆粒的毒性作用具有其獨(dú)特性[18]。

如前所述，藍(lán)藻水華會對水蚤產(chǎn)生影響。其中部分原因在于藍(lán)藻次級代謝產(chǎn)物(如蛋白酶抑制劑)對水蚤消化系統(tǒng)的抑制作用。通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)分析，Schwarzenberger等[36]在大型溞中發(fā)現(xiàn)并鑒定出了9種不同的蛋白酶。他們認(rèn)為，水蚤通過上調(diào)相應(yīng)蛋白酶的表達(dá)來對食物中的蛋白酶抑制劑做出響應(yīng)。其中，胰蛋白酶和糜蛋白酶上調(diào)了1.4倍至25.6倍，并且他們證明水蚤的這種反應(yīng)與前述微囊藻毒素的作用是無關(guān)的。

4 代謝組學(xué)研究(Metabonomics research)

與基因組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相比，代謝組學(xué)技術(shù)在生態(tài)毒理學(xué)研究中應(yīng)用較晚。這一研究手段主要基于核磁共振技術(shù)(NMR)及生物體內(nèi)代謝物的質(zhì)譜分析。與蛋白質(zhì)組學(xué)研究類似，大多數(shù)的生態(tài)代謝組學(xué)研究都集中在探討在實(shí)驗(yàn)室或野外環(huán)境中，暴露于不同類型環(huán)境化學(xué)污染物的生物體內(nèi)所觀察到的不同代謝特征。直接輸注傅里葉變換離子回旋共振質(zhì)譜(DI FT-ICR MS)技術(shù)是一種高通量、超高分辨率的方法，常被代謝組學(xué)研究所使用。Taylor等[37-38]采用FT-ICR MS方法，研究了重金屬Cu對大型溞的急性代謝組學(xué)效應(yīng)及其毒性模式。Poynton等[39]將代謝組學(xué)技術(shù)與轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)相結(jié)合，通過GO(Gene Ontology)富集和KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路分析，發(fā)現(xiàn)在24 h亞致死濃度的鎘暴露下大型溞的營養(yǎng)攝入及代謝受到干擾，導(dǎo)致能量合成抑制，從而引起慢性毒性效應(yīng)。另外一項(xiàng)基于1H-NMR技術(shù)的代謝組學(xué)研究，利用主成分分析(principal component analysis, PCA)的方法研究砷、銅和鋰對大型溞暴露48 h所引起的亞致死效應(yīng)。結(jié)果表明，鋰和銅表現(xiàn)出類似的代謝模式，二者都是通過干擾能量儲存及調(diào)控而產(chǎn)生毒性效應(yīng)，而砷暴露引起的代謝改變與對照組相比無顯著性差異[40]。Taylor等[41]采用OECD 21 d繁殖試驗(yàn)方法，測試鎘、2,4-二硝基苯酚和普萘洛爾3種水環(huán)境污染物對大型溞的生殖毒性，結(jié)合質(zhì)譜法測量這些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的代謝變化特征，從而發(fā)現(xiàn)了潛在的生物標(biāo)志物并用來預(yù)測3種化學(xué)物質(zhì)的生殖毒性。雖然這些發(fā)現(xiàn)的適用性僅限于3種化學(xué)物質(zhì)，但對水蚤慢性適應(yīng)性的早期反應(yīng)代謝生物標(biāo)志物的研究具有重要參考價(jià)值。

5 表觀遺傳組學(xué)研究(Epigenomics research)

表觀遺傳學(xué)(epigenetics)是指基于非基因序列改變所致的基因表達(dá)水平的變化，如DNA甲基化、組蛋白修飾和RNA干擾等；而表觀基因組學(xué)則是在基因組水平上對表觀遺傳學(xué)改變的研究。目前的研究已表明，表觀遺傳學(xué)標(biāo)志物可受多種環(huán)境因素的影響。Vandegehuchte等[42]利用超高效液相色譜(UPLC)和基因芯片技術(shù)，對大型溞暴露于多種環(huán)境化學(xué)污染物后其DNA甲基化水平及轉(zhuǎn)錄譜進(jìn)行研究。結(jié)果表明，全基因組及局部DNA的甲基化水平可被5-氮胞苷(5-azacytidine)、農(nóng)利靈(vinclozolin)、染料木黃銅(genistein)及鋅(zinc)所改變；而5-脫氧胞苷(5-aza-2’-deoxycytidine)、雙酚A(bisphenol A)和鎘(cadmium)則不能影響其DNA甲基化水平。近年來組學(xué)分析還發(fā)現(xiàn)，環(huán)境毒物的暴露可引起水蚤多種與生長發(fā)育相關(guān)的基因發(fā)生表觀遺傳學(xué)改變。例如，利用亞硫酸鹽測序技術(shù)(bisulfite sequencing)、甲基化DNA免疫共沉淀技術(shù)(methylated DNA immunoprecipitation)等對DNA甲基化的研究發(fā)現(xiàn)，在環(huán)境毒物的暴露下，水蚤的體長、產(chǎn)卵量和性別分化等受到影響，而相應(yīng)的水蚤生長和繁殖相關(guān)基因的DNA甲基化也發(fā)生異常改變[43]。

環(huán)境污染物的代際傳遞是生態(tài)毒理學(xué)家們關(guān)注的環(huán)境問題。研究表明，瞬時(shí)化學(xué)暴露的影響可以通過表觀遺傳轉(zhuǎn)移到非暴露的世代。如果這是一個(gè)普遍的現(xiàn)象，它可能會對當(dāng)前的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估產(chǎn)生重大影響。Vandegehuchte等[44]利用優(yōu)化的LC-MS/MS方法，通過測定5-甲基-2’-脫氧胞苷(5mdC)總含量對鋅暴露下大型溞的DNA甲基化水平進(jìn)行了定量，并評估了Zn暴露對跨代5mdC含量的影響。結(jié)果表明，親代Zn暴露后的F1代水蚤DNA甲基化水平出現(xiàn)顯著的降低。但這種效應(yīng)并沒有延續(xù)到下一代(F2代)中。這一發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究表觀遺傳學(xué)在水生毒理學(xué)中的作用開辟了道路。

綜上，將水蚤組學(xué)研究的主要方法及相關(guān)污染物類型總結(jié)于表1中。

6 展望(Prospects)

由于水蚤具有生長繁殖快、分布范圍廣和對環(huán)境變化敏感等特點(diǎn)，已成為廣泛應(yīng)用的模式生物，從而為多種環(huán)境污染物的生態(tài)毒理學(xué)研究提供了有利工具。同時(shí)，在水蚤生態(tài)毒理學(xué)研究中，組學(xué)技術(shù)和指紋識別方法的應(yīng)用和發(fā)展，也為生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估提供了重要的理論和技術(shù)支撐。作為一門新興學(xué)科，水蚤分子毒理基因組學(xué)需要依賴于高通量、高分辨率的分析技術(shù)與完整的生物信息學(xué)系統(tǒng)，到目前為止仍存在很多挑戰(zhàn)。首先，如何將常規(guī)的毒理學(xué)分析結(jié)果與組學(xué)數(shù)據(jù)相結(jié)合，通過考察不同污染物暴露下水蚤的基因及蛋白表達(dá)、以及內(nèi)源性代謝物的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，對污染物的毒性作用靶點(diǎn)和關(guān)鍵信號通路進(jìn)行定性分析，以揭示毒物對水蚤的作用及損害機(jī)制；其次，多組學(xué)技術(shù)是一種強(qiáng)有力的工具，其高通量篩選特征為研究外界干擾對生物體的刺激提供新的視角，成為毒理學(xué)發(fā)展的新趨勢。目前在水蚤中，僅有少數(shù)物種獲得了全基因組序列，缺乏蛋白和內(nèi)源代謝物的信息。如何基于多組學(xué)技術(shù)(如轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄組和代謝組等)，探討不同污染物對水蚤的毒性作用機(jī)制，并對生物標(biāo)志物進(jìn)行分析和篩查，是水蚤多組學(xué)研究面臨的問題；第三，利用水蚤孤雌生殖的特性，通過表觀遺傳組學(xué)技術(shù)，對污染物的代際傳遞效應(yīng)進(jìn)行分析，進(jìn)而從種群水平對污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評估，還需要大量的數(shù)據(jù)積累與分析。

表1 水蚤組學(xué)研究的主要方法及相關(guān)污染物類型Table 1 Main research methods and related pollutant types in omics study of water flea