基于人工氣候培養(yǎng)箱的34 個煙草品種萌發(fā)期耐鹽性評價

王悅霖，葉協(xié)鋒，宋佳倩，李雪利，余海濤，荊永鋒，姚鵬偉，武云杰，王 靜*

1.河南農業(yè)大學煙草學院 國家煙草栽培生理生化研究基地 煙草行業(yè)煙草栽培重點實驗室，鄭州市金水區(qū)文化路95 號 450002

2.中國煙草總公司職工進修學院，鄭州市鑫苑路7 號 450008

3.湖南中煙工業(yè)有限責任公司，長沙市雨花區(qū)萬家麗中路三段188 號 410000

世界糧農組織在2016 年的報告中提出，土壤鹽漬化、有限的耕地面積以及突發(fā)的自然災害使現代農業(yè)的發(fā)展面臨著前所未有的挑戰(zhàn)［1］。目前世界鹽漬土壤面積約為1.00×1010hm2，中國的鹽漬土壤約有3.67×107hm2，我國耕地的次生鹽漬土壤面積約為9.20×106hm2，占耕地總面積的6.6%［2］。對我國植煙土壤的研究也發(fā)現，部分植煙土壤已出現土壤鹽漬化現象。趙莉［3］對湖南植煙土壤鹽分調查發(fā)現，湖南地區(qū)植煙土壤鹽分表聚現象嚴重，從而影響煙草的正常生長以及調制后的煙葉質量。馬靜等［4］對洛陽典型植煙土壤鹽分含量進行分析后認為，洛陽部分植煙土壤已經表現出輕度鹽漬化現象。目前，土壤鹽漬化的成因大多是由生產中不合理的耕作方式、灌溉、施肥等農業(yè)措施帶來的，并成為影響農業(yè)生產較嚴重的非生物脅迫之一［5］。

在植物生長過程中，種子萌發(fā)期是對外界環(huán)境最敏感的時期，也是研究植物耐鹽性的重要時期［6］。種子萌發(fā)期的耐鹽情況可在一定程度上反映該物種的耐鹽性［7］，許多植物均以萌發(fā)期的耐鹽性進行種質的抗鹽脅迫評價。近年來，不同學者對花生［8］、谷子［9］、粳稻［10］等作物進行了種子萌發(fā)期的耐鹽性調查和研究，田蕾等［10］采用相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率、發(fā)芽指數和相對鹽害率作為粳稻耐鹽性指標，并對64 份粳稻種質進行了耐鹽性評價；李明雨等［11］通過主成分分析后選擇相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢和相對活力指數等作為衡量品種耐鹽性的相關指標；張志飛等［12］采用主成分分析法計算分析后選擇相對活力指數和相對發(fā)芽率對66 份白三葉種質進行耐鹽性評價。在煙草品種的耐鹽性研究中，龔理［13］對不同濃度NaCl 溶液脅迫下7 個品種不同生長時期的耐受性進行了鑒定和評價，得出相對含水率、單株干質量、相對電導率、MDA、K+含量、最大葉長、發(fā)芽指數、株高、發(fā)芽勢、葉綠素含量、蛋白質含量和根系活力等12個指標在NaCl 濃度為150 mmol/L 時變異系數最大，可作為耐鹽性定量鑒定的指標。葉協(xié)鋒等［14］在種子萌發(fā)期選用不同濃度的復合鹽堿處理，研究了5 個烤煙主栽品種的發(fā)芽特性。然而在目前的研究中對于不同煙草類型種質的耐鹽性則鮮見報道。為此，采用NaCl 模擬鹽脅迫環(huán)境條件，對烤煙、白肋煙和香料煙的34 個品種在萌發(fā)期進行耐鹽性評價與分級，以期為煙草耐鹽品種選育和植物耐鹽機制研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試煙草種質選自國內外煙草種植主產區(qū)的主栽品種和典型品種，品種名稱與來源見表1。

表1 供試材料及來源Tab.1 Sources of test germplasms

1.2 試驗方法

1.2.1 鹽脅迫濃度篩選

以K326 品種作為篩選NaCl 濃度的試驗材料。選取均勻飽滿的種子，用0.2%高錳酸鉀溶液消毒，浸泡30 min 后，用去離子水沖洗10 次，洗凈種子表面殘留的高錳酸鉀后，在超凈臺上均勻地點播在MS 培養(yǎng)基中。待6 d 后從培養(yǎng)基中挑選根長為7～8 mm 的煙草幼苗，分別轉移到加有50、100、150、200 和250 mmol/L NaCl 的新MS 培養(yǎng)基中；移入新培養(yǎng)基的日期記為第0 天，在鹽脅迫第5 天時測量各處理煙草幼苗根系長度，統(tǒng)計根系伸長值，計算出能夠引起根伸長下降50%的NaCl 濃度（EC50）［15］。

1.2.2 各品種耐鹽性評價

選取均勻、飽滿的種子；使用0.2%高錳酸鉀溶液消毒，浸泡30 min 后，用去離子水沖洗10 次，洗凈種子表面殘留的高錳酸鉀后備用。

各品種均設置脅迫處理和對照，每個處理設置3 次重復，每重復100 粒種子。采用潔凈滅菌后的玻璃培養(yǎng)皿、脫脂棉及濾紙，采用1.2.1 節(jié)中篩選出的最適濃度的NaCl 溶液作為培養(yǎng)液進行脅迫培養(yǎng)，以去離子水作為對照培養(yǎng)。在潔凈的培養(yǎng)皿中將濕滅菌后的脫脂棉和濾紙用鹽溶液和去離子水浸濕后，鋪平在培養(yǎng)皿中，在表層濾紙上均勻點播100 粒消毒后的種子，在人工氣候培養(yǎng)箱（MGC-350BP-2L，上海一恒科學儀器有限公司）中培養(yǎng)。設置光強為4 950 Lx，光照時長為12 h/d，相對濕度60%，溫度為26 ℃。每日定時觀察，及時補充去離子水或150 mmol/L NaCl 溶液，并統(tǒng)計種子發(fā)芽粒數，以胚根超過種子長度的1/2 為發(fā)芽標準［14］。在培養(yǎng)第14 天時，從每個培養(yǎng)皿中隨機選出10 棵幼苗測量根長。測定指標［14］：

發(fā)芽勢（Germination potential，GP）=（培養(yǎng)7 d種子發(fā)芽數/供試種子粒數）×100% （1）

相 對 發(fā) 芽 勢（Relative germination potential，RGP）=鹽脅迫下發(fā)芽勢/對照處理下發(fā)芽勢×100%（2）

發(fā)芽率（Germination rate，GR）=（培養(yǎng)14 d 種子發(fā)芽數/供試種子粒數）×100% （3）

相對發(fā)芽率（Relative germination rate，RGR）=鹽脅迫下發(fā)芽率/對照處理下發(fā)芽率×100% （4）

萌發(fā)指數（Germination index，GI）=∑（第n 天種子發(fā)芽數/相應發(fā)芽天數） （5）

相對萌發(fā)指數（Relative germination index，RGI）=鹽脅迫下萌發(fā)指數/對照處理萌發(fā)指數×100% （6）

活力指數（Vigor index，VI）=GI×S（S 指種苗生長量，為脅迫14 d 的根長）×100% （7）

相對活力指數（Relative vigor index，RVI）=鹽脅迫下活力指數/對照處理下活力指數×100%（8）

相對鹽害率（Relative salt injury rate，RSIR）=（對照發(fā)芽率-處理發(fā)芽率）/對照發(fā)芽率×100%（9）

1.3 數據處理

采用DPS 7.0 和SPSS 24.0 軟件進行數據統(tǒng)計分析，使用相關性分析和因子主成分分析方法對各項觀測指標的相對值進行耐鹽性評價指標篩選；利用主成分分析計算得到各指標的得分系數和累計貢獻率，采用權重公式得到各品種的綜合得分，選擇歐氏距離組間平均連鎖法對34 份材料耐鹽性總值進行聚類分析，并劃分耐鹽等級。

式中：Pj表示j 個指標的貢獻率；Wj表示第j 個指標的權重。

2 結果與分析

2.1 鹽脅迫濃度的篩選

在不同的鹽濃度處理下，幼苗的根系呈不同的生長狀態(tài)，表現出低濃度促進生長而高濃度抑制生長的規(guī)律。由圖1 可知：在50 mmol NaCl 處理下，煙草幼苗根長較對照增加2.32%；在100 mmol NaCl 處理下，根長較對照降低30.13%；在150 mmol NaCl 處理下，根長較對照降低53.15%；而在250 mmol NaCl 處理下，根長較對照降低80.30%。以引起煙草幼苗根長下降50%的NaCl 濃度（150 mmol/L）作為后續(xù)試驗中的鹽脅迫處理濃度。

圖1 不同濃度鹽脅迫處理下K326 根長增加量的變化Fig.1 Increases in root length of K326 under different salt stress treatments

2.2 鹽脅迫對不同煙草品種萌發(fā)期生長的影響

34 個煙草品種在鹽脅迫處理下與其對照相比，發(fā)芽率和根長等表征指標均呈現顯著下降趨勢，脅迫處理下各品種較對照表現出黃化現象（圖2）。在對照條件下，培養(yǎng)7 d 時各品種發(fā)芽勢表現不一，變異系數達12.83%（表2），說明不同品種間本身存在一定的差異；培養(yǎng)14 d 時，各品種發(fā)芽率均高于67%，其中發(fā)芽率高于80%的品種占58.8%，說明煙草種子的活力較為一致。在鹽脅迫下，各品種的發(fā)芽情況差異明顯，其中鹽脅迫處理發(fā)芽情況較好的品種有YC01、YC03 和YC32，發(fā)芽率均超過60%，尤其是YC32 品種發(fā)芽率超過80%；鹽脅迫處理下發(fā)芽率在30%～60%的有6 個品種，在10%～30%的有13 個，鹽脅迫下品種發(fā)芽率低于10%的共12 個，其中品種YC15 對鹽脅迫高度敏感，發(fā)芽率為0；各品種的根系生長都受到抑制，根長小于1 mm 的有7 個品種（占20.59%）；根長1～2 mm 的有17 個品種（占50%）；根長＞2 mm的有10 個品種（占29.41%），其中以YC32 根長表現最為突出，為4.95 mm。各品種的相對鹽害率都處于較高的水平，說明各品種在鹽脅迫條件下都受到較大的傷害；YC01、YC26 和YC29 等品種表現較為突出，其相對鹽害率較低。在脅迫處理下不同煙草品種的各項指標變異系數均較對照提高，不同品種的平均發(fā)芽率由81.76%降低到24.93%，根長平均值由18.16 mm 降低至1.64 mm，活力指數在脅迫處理后比對照組降低90.95%。這表明在鹽脅迫條件下，各品種煙草的生長發(fā)育都受到了抑制。鹽脅迫處理下各煙草品種單一鹽害指標的變異系數較大，尤其是活力指數的變異系數高達195.42%，說明34 個品種在鹽脅迫培養(yǎng)的條件下生長情況差異較大。從各指標的變異系數來看，在對照和鹽脅迫處理下變異系數最大的指標均為活力指數，說明活力指數是最能反映各品種間發(fā)芽情況差異的指標。無論是直觀的鹽害指標還是綜合的鹽害指標在各品種之間波動都較大，分層明顯，說明不同品種之間耐鹽性差異顯著。

圖2 不同耐鹽性品種對照和鹽脅迫處理的發(fā)芽率比較Fig.2 Germination rates of different salt tolerant germplasms under the salt stress and control treatments

表2 34 個煙草品種鹽脅迫處理和對照的表征指標統(tǒng)計Tab.2 Statistics of characteristic indexes of 34 germplasms under the salt stress and control treatments

表2 （續(xù)）

2.3 不同品種綜合性耐鹽指標的相關性分析

對34 個不同煙草品種各相對指標之間進行兩兩相關性分析，結果見表3。相對發(fā)芽勢與各項指標均無顯著相關性，相對鹽害率與大部分指標之間都存在極顯著負相關關系，特別是相對鹽害率與相對萌發(fā)指數兩個指標之間的相關系數高達-0.79。除相對發(fā)芽勢外，相對發(fā)芽率、相對發(fā)芽勢、相對萌發(fā)指數和相對活力指數之間均存在正顯著相關關系（P＜0.05）或正極顯著相關關系（P＜0.01），各指標之間關聯(lián)密切，相對活力指數與相對萌發(fā)指數兩個指標的相關系數高達0.88，相對發(fā)芽勢與所有指標均無顯著相關關系。

表3 不同品種鹽害評價相對指標的相關性分析①Tab.3 Correlation analysis of relative indexes for salt damage evaluation of different germplasms

2.4 不同品種綜合性耐鹽指標主成分分析

對34 個煙草品種的6 個相對指標進行主成分分析，提取得到2 個主成分。主成分Ι的特征值為3.575，貢獻率為59.591%；主成分Ⅱ的特征值為1.402，貢獻率為23.999%；兩者的累計貢獻率達到83.59%，滿足各主成分特征值大于1，累計貢獻率大于80%的條件，因此這2 個主成分可以涵蓋各品種萌發(fā)期在鹽脅迫培育下的主要耐鹽情況。結合各因子載荷矩陣與得分系數（表4）可以看出：在主成分Ι中相對發(fā)芽率、相對萌發(fā)指數、相對根長和相對活力指數都具有較高的正向載荷，均在0.8 以上，相對鹽害率具有較高的負向載荷，根據各項指標的得分系數可得到第一主分量F1=0.22×RGP+0.49×RGR+0.45×RTL+0.49×RGI+0.43×RVI-0.38×RSIR。在主成分Ⅱ中只有相對活力指數具有較高的正向載荷，載荷量為0.56，其他指標在主成分Ⅱ中載荷量都較低，其中相對發(fā)芽勢、相對發(fā)芽率和相對根長均為負向載荷，相對萌發(fā)指數和相對鹽害率為正向載荷。根據主成分Ⅱ的得分系數情況可得出第二主分量F2=0.14×RGI+0.47×RVI+0.12×RSIR-0.12×RGP-0.12×RGR-0.2×RTL。

表4 綜合性耐鹽指標在主成分Ⅰ和主成分Ⅱ的因子載荷及成分得分系數Tab.4 Factor loading and component score coefficient of comprehensive indexes of salt tolerance in principal component I and principal component Ⅱ

2.5 不同品種耐鹽性聚類分析

根據主成分的累計貢獻率情況可得出兩個主成分的權重分別為71.55%和28.45%，因此根據權重公式來計算出各品種最后得分F 值，采用綜合得分F 值來對各品種進行排序（表5），并采用歐式距離和組間平均距離連鎖法對34 個品種進行聚類分析，從而評價各品種的耐鹽性。34 個煙草品種按照耐鹽性在歐氏距離10 處可劃分為4 類（圖3）：由表6 整理可得：高耐鹽品種僅有1 個，為YC32 香料煙巴斯瑪（選取得分F 值為0.78），這與之前的觀測相符合；較耐鹽品種5 個，以K326（選取得分F 值為0.53）和DS26（選取得分F 值為0.51）為代表，占總品種數的14.7%；較敏感品種10 個，以中煙100和Spt168 為代表，占總品種數的29.4%；高敏感品種18 個，以NC82（選取得分F 值為-0.24）和K346（選取得分F 值為-0.05）為代表，占總品種數的52.94%。

表5 34 個品種特征值排序Tab.5 Rank of 34 germplasms in the order of characteristic values

圖3 34 個品種的聚類分析Fig.3 Cluster analysis of 34 germplasms

表6 34 個品種耐鹽等級分類Tab.6 Classification of 34 germplasms based on salt tolerance

3 討論

有研究證明，在植物萌發(fā)期的發(fā)芽率和根長會隨著鹽脅迫濃度升高而降低［10-16］；外界鹽脅迫主要是通過滲透脅迫對植物造成傷害，從而使種子失去萌發(fā)和繼續(xù)生長的能力［17］。在植物的苗期，鹽脅迫對植物的傷害更多體現為葉綠素含量和干物質積累量的減少［18-20］、MDA 含量的上升、抗氧化酶活性的變化以及脯氨酸和可溶性糖含量的變化［21-23］；外界高濃度鹽離子會與植物生長所需的無機離子產生纈抗［24-25］從而造成缺素，影響植物的正常生長。此外，過高的滲透壓也會影響植物的細胞壁厚度和亞細胞結構［26］。在評價不同作物萌發(fā)期的耐鹽性時，衡量各品種耐鹽性的指標也有較大差異［27］。韓飛等［28］選擇發(fā)芽率、發(fā)芽指數、相對鹽害率和相對根長等指標作為評價63個谷子品種耐鹽性的主要指標，而孫東雷等［8］則選用活力指數、發(fā)芽率、鮮質量、相對含水量等指標來鑒定花生品種的耐鹽性。此外，趙俊香等［16］在研究菊芋品種耐鹽性中除了常規(guī)的干質量、鮮質量指標之外還添加了MDA、脯氨酸等生理指標的測定。綜合上述指標，并結合煙草種子的大小和萌發(fā)特性等實際因素，本試驗中采用發(fā)芽率、活力指數、根長等指標的相對值進行分析，經過主成分分析后可以得到兩個主成分綜合權重最高的指標，即最能反映各品種在鹽脅迫下發(fā)芽情況的指標為相對活力指數，得分緊隨其后的指標為相對萌發(fā)指數。因此在本試驗的評價體系中確定的指標為相對活力指數和相對萌發(fā)指數。

在本試驗中，34 個煙草品種在鹽脅迫處理下的表征指標都受到了較嚴重的影響，各品種發(fā)芽率降低，根長明顯變短，生長緩慢，且大部分品種發(fā)芽率較對照下降50%以上，鹽脅迫處理下煙草幼苗出現黃化的現象。各品種在脅迫處理后，各鑒定指標變異系數變大，說明品種之間差異較大且不同耐鹽性種質之間分層明顯。在鹽脅迫下各指標的變異系數呈現活力指數＞發(fā)芽勢＞萌發(fā)指數＞發(fā)芽率＞根長＞相對鹽害率的趨勢，這說明鹽脅迫在煙草種子萌發(fā)時期的傷害是先通過影響種子萌發(fā)的滲透勢條件，進而再影響根長的伸長來限制煙草的生長發(fā)育。在劃分的4 個耐鹽等級中，高耐鹽種質香料煙巴斯瑪在脅迫后的根長仍可達到5 mm 左右，發(fā)芽率高達86%，其耐鹽表現最為突出。

此外，本試驗中收集的煙草品種還包括雪茄煙和地方晾曬煙等10 余個，但由于這些品種的生育期和萌發(fā)期特性與大多數品種不同，不能滿足本試驗評價體系的要求，故無法對其耐鹽性進行評價。因此，若要更加全面地分析不同類型煙草品種的耐鹽性，還需要對煙草品種的不同時期生理生化和遺傳特性等進行更深入研究。

4 結論

在人工氣候箱培養(yǎng)條件下，對34 個煙草品種進行萌發(fā)期耐鹽性綜合評價結果表明：①鹽脅迫影響煙草幼苗生長的EC50為150 mmol/L。②根據不同煙草品種萌發(fā)時期的相對指標提取出2 個主成分，通過隸屬函數值方法將34 個品種劃分為高耐鹽品種（香料煙Basma）、較耐鹽品種（烤煙K326、云煙87，白肋煙DS26、va1061 和va509）、較敏感品種（烤煙Spt168、中煙100、NC89、秦煙97，白肋煙KY907、TN86、va1048、TN90，香料煙沙姆遜和伊茲密爾）和高敏感品種（烤煙NC82、K399、吉煙9 號、RG11、秦煙96、NC55、NC567、NC95、遵煙6 號、K394、巖煙97、K358、紅花大金元、Hicks、K346、Coker176、CV87，白肋煙va1052）4 個等級。