加味滌痰湯對(duì)腦缺血再灌注損傷大鼠腦細(xì)胞自噬的特異性

陳維達(dá) 劉曉婷 陳澤濤

(1山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355；2山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院；3濰坊市中醫(yī)院)

缺血性腦卒中是腦血管病最常見(jiàn)的一種類(lèi)型，占全部腦卒中的60%～80%〔1〕，中醫(yī)方面又稱(chēng)“中風(fēng)”。它導(dǎo)致的神經(jīng)功能障礙常對(duì)患者的生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響，且發(fā)病率、致殘率、復(fù)發(fā)率極高。滌痰湯出自《濟(jì)生方》,有益氣祛痰、化濁開(kāi)竅的功能，是治療急性期缺血性腦卒中的有效方劑。劉曉婷等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)，加味滌痰湯灌胃對(duì)缺血再灌注(CIR)損傷大鼠神經(jīng)功能有保護(hù)作用，但并未詳細(xì)探討滌痰湯對(duì)CIR損傷關(guān)于自噬方面的具體機(jī)制。已有研究表明〔3〕，自噬在CIR損傷中具有重要作用。自噬不僅參與細(xì)胞死亡，同時(shí)也是細(xì)胞在惡劣環(huán)境中維持自我內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的一種保護(hù)機(jī)制。本文通過(guò)對(duì)大鼠進(jìn)行右側(cè)大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)構(gòu)建CIR模型，探討加味滌痰湯對(duì)CIR損傷大鼠腦細(xì)胞自噬的影響。

1 材料與方法

1.1材料 2016年2月至2017年2月選取SPF級(jí)雄性SD大鼠90只(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供)，體重140～160 g。加味滌痰湯方藥組成：膽南星 12 g、石菖蒲10 g、橘紅10 g、梔子10 g、枳實(shí)10 g，半夏9 g，水蛭6 g、生大黃6 g；采用北京康仁堂藥業(yè)全成分中藥配方顆粒，每劑 9.6 g。吡拉西坦片(山東仁和堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào) 20160122，劑量：0.4 g/片)。Western印跡主要試劑見(jiàn)表1。

1.2構(gòu)建CIR損傷模型 術(shù)前禁食、禁水6 h。以10%水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，麻醉滿(mǎn)意后，參照Clark等〔4〕的方法，對(duì)大鼠進(jìn)行可逆性MCAO線(xiàn)栓法栓塞右側(cè)大腦中動(dòng)脈，縫合皮膚切口。術(shù)中以加熱板保持大鼠肛溫在37℃左右。假手術(shù)組除不插入線(xiàn)栓外余手術(shù)過(guò)程相同。缺血90 min后拔出栓線(xiàn)進(jìn)行CIR，90 min 后參照Longa等〔5〕制定的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能障礙評(píng)分。本實(shí)驗(yàn)選用神經(jīng)功能評(píng)分為1～3分進(jìn)行右側(cè)MCAO成功的大鼠和0分的假手術(shù)大鼠。

表1 Western印跡主要試劑

LC3-Ⅱ:自噬相關(guān)蛋白微管相關(guān)蛋白1輕鏈Ⅱ

1.3實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)共分為5組：假手術(shù)組隨機(jī)納入假手術(shù)大鼠5只；模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組各隨機(jī)納入造模成功的CIR損傷的大鼠各5只。

1.4方法 于造模成功后24 h給藥，1次/d，連續(xù)給藥7 d，中藥高劑量組給予加味滌痰湯0.768 g/(kg·d)，中藥低劑量組給予加味滌痰湯0.384 g/(kg·d)，西藥組給予吡拉西坦片0.1 g/(kg·d)，假手術(shù)組與模型組給予等量的生理鹽水，灌胃容積為10 ml/kg。于給藥周期結(jié)束24 h內(nèi)，每組取5只大鼠采用Western印跡測(cè)定腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin1、Bcl-2的表達(dá)。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD-t法。

2 結(jié) 果

2.1用藥后各組腦組織LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2的表達(dá) 與假手術(shù)組比較，模型組缺血腦組織中LC3-Ⅱ、Beclin 1、Bcl-2表達(dá)顯著升高(P<0.05)。與模型組比較，中藥高劑量組、低劑量組及西藥組LC3-Ⅱ、Bcl-2表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。中藥高劑量組及西藥組Beclin1表達(dá)顯著下降(P<0.05)，見(jiàn)圖1、表2。

1～5：假手術(shù)組、模型組、中藥高劑量組、中藥低劑量組、西藥組圖1 用藥后各組腦組織LC3-Ⅱ的表達(dá)

表2 各組Bcl-2、Beclin1、LC3-Ⅱ表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

3 討 論

滌痰湯是腦卒中急性期治療的傳統(tǒng)方劑，具有滌痰開(kāi)竅之功效。近年來(lái)，在缺血CIR動(dòng)物模型與體外細(xì)胞培養(yǎng)等方面的研究進(jìn)一步明確了滌痰湯藥理作用的機(jī)制。張勇等〔6〕將CIR損傷大鼠MCAO隨機(jī)分組，結(jié)果顯示術(shù)后72 h滌痰湯組較模型組神經(jīng)功能缺損程度顯著改善，腦組織受損程度明顯減輕。劉玲等〔7〕用同樣的方法進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)術(shù)后72 h滌痰湯組缺血側(cè)腦組織細(xì)胞凋亡率明顯降低，表明滌痰湯的神經(jīng)保護(hù)作用可能與抑制缺血后細(xì)胞凋亡有關(guān)。本研究采用的加味滌痰湯是在滌痰湯基礎(chǔ)上化裁而來(lái)，治療腦卒中急性期痰瘀互結(jié)、化熱動(dòng)風(fēng)者。

自噬是真核細(xì)胞利用溶酶體對(duì)衰老、過(guò)剩的生物大分子(如蛋白質(zhì))及受損的細(xì)胞器進(jìn)行分解代謝的過(guò)程〔8〕。既往研究證明〔9〕，缺血缺氧是自噬激活的重要誘因之一。自噬過(guò)程由一系列自噬相關(guān)蛋白(Atg蛋白)介導(dǎo)完成，LC3是自噬體膜上的標(biāo)記蛋白。LC3-Ⅱ被用來(lái)作為自噬體的標(biāo)記，其水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量〔10〕。本研究結(jié)果表明，在缺血CIR發(fā)生發(fā)展的病理過(guò)程中自噬機(jī)制參與其中，且自噬是被激活的，這與既往研究結(jié)果相同〔9〕。另外，LC3-Ⅱ表達(dá)的降低反映出自噬受到抑制。因此，CIR發(fā)生后自噬加劇缺血后的腦損傷；加味滌痰湯能減輕CIR后的腦損傷，其機(jī)制與抑制CIR損傷后發(fā)生的自噬有關(guān)。

Beclin1基因是哺乳動(dòng)物參與自噬的特異性基因，是形成自噬體的必需分子，在一定程度上可代表自噬的活性，能夠調(diào)節(jié)自噬體膜合成和物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)。Bcl-2家族是一組結(jié)構(gòu)域的高度同源蛋白系列，在細(xì)胞凋亡中起重要調(diào)節(jié)作用。Bcl-2作為經(jīng)典的抗凋亡蛋白，在調(diào)控細(xì)胞自噬的過(guò)程中也有重要作用。此外，Bcl-2還能通過(guò)多種機(jī)制調(diào)控氧化應(yīng)激，而氧化應(yīng)激在誘導(dǎo)自噬和凋亡中均發(fā)揮作用〔11,12〕。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定時(shí)，Beclin1與Bcl-2家族蛋白持續(xù)結(jié)合，并抑制自噬的發(fā)生。Bcl-2蛋白能阻止Beclin1蛋白與調(diào)控因子Ⅲ型磷脂酰肌醇3激酶(PI3KC3)特異性結(jié)合，或減少PI3KC3磷酸化活性而起到抑制自噬的作用。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生饑餓或應(yīng)用自噬誘導(dǎo)劑使自噬增強(qiáng)時(shí)，繼而發(fā)生Beclin1與Bcl-2的解聚〔13〕，使Beclin1依賴(lài)的自噬增加，提示Bcl-2對(duì)自噬起抑制作用。由此可見(jiàn)，自噬與凋亡之間存在復(fù)雜的調(diào)控關(guān)系，而B(niǎo)eclin1與Bcl-2的平衡狀態(tài)則是調(diào)控自噬與凋亡互反饋?zhàn)饔玫年P(guān)鍵因素。

本研究結(jié)果說(shuō)明，在缺血缺氧條件下，機(jī)體通過(guò)上調(diào)Beclin1的表達(dá)來(lái)誘導(dǎo)自噬的激活；同時(shí)，Bcl-2表達(dá)的升高表明抗凋亡作用的增強(qiáng)。目前普遍認(rèn)為自噬和凋亡在特定情況下可以相互轉(zhuǎn)化，共同促進(jìn)細(xì)胞死亡。自噬抑制凋亡的主要機(jī)制是線(xiàn)粒體自噬，線(xiàn)粒體受損時(shí)細(xì)胞內(nèi)的自噬激活因子會(huì)被激活，使細(xì)胞啟動(dòng)自噬來(lái)挽救細(xì)胞，自噬就會(huì)對(duì)受損的線(xiàn)粒體進(jìn)行捕捉并將其降解消除，以防止細(xì)胞發(fā)生凋亡〔14〕。本研究表明，中藥高劑量組能有效抑制自噬；且高劑量組優(yōu)于低劑量組，表明存在量效關(guān)系，高劑量能更有效抑制自噬的發(fā)生。

綜上，加味滌痰湯能通過(guò)干預(yù)腦缺血CIR損傷后的自噬，調(diào)節(jié)自噬活性，抑制LC3-Ⅱ、Beclin1的表達(dá)，有效下調(diào)自噬，起到缺血CIR后神經(jīng)保護(hù)的作用。但自噬發(fā)生的機(jī)制及調(diào)節(jié)通路十分復(fù)雜，本文僅就加味滌痰湯對(duì)自噬的影響做了研究，至于其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)的分子機(jī)制、確切的調(diào)節(jié)通路及如何調(diào)控自噬與凋亡的發(fā)生等問(wèn)題，有待進(jìn)一步研究。