基于TLR4/MyD88信號通路探討大黃靈仙方緩解膽管細(xì)胞炎癥反應(yīng)的作用研究

吳華帥,俞淵，陳金梅，甘苡蓉，李承積

(1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽外科，廣西 南寧 530023)

膽管炎癥反應(yīng)是膽石癥發(fā)病的關(guān)鍵病理環(huán)節(jié)。研究表明，膽管炎癥引起的炎性狹窄，易造成膽管梗阻，長時(shí)間的梗阻常使膽汁引流不暢，容易形成膽石癥[1]。膽管炎癥與結(jié)石互相作用、互為因果，造成患者的長期病痛及疾病反復(fù)發(fā)作。長期受結(jié)石、淤積膽汁及炎癥物質(zhì)的刺激，膽道甚至易發(fā)生癌變，導(dǎo)致膽管癌[2]。如何預(yù)防和緩解膽道炎癥反應(yīng)，是治療膽石癥等膽道疾病的關(guān)鍵。

前期研究發(fā)現(xiàn)，大黃靈仙方能有效緩解膽管周圍組織炎性損傷[3]。大黃靈仙方是治療膽石癥的經(jīng)驗(yàn)要方，以生大黃、威靈仙、芒硝、金錢草、枳殼、雞內(nèi)金、澤蘭、柴胡、郁金、磁石、黃芪、甘草為主要藥物，全方共奏疏肝利膽、攻下排石之功效。但從藥理角度而言，大黃靈仙方如何干預(yù)膽石癥的機(jī)制不甚明了。研究表明，TLR4/MyD88信號通路在調(diào)節(jié)膽道炎癥機(jī)制反應(yīng)上具有關(guān)鍵性作用[4]。本研究將從TLR4/MyD88信號通路探討大黃靈仙方減輕膽管細(xì)胞炎癥損傷的具體機(jī)制，進(jìn)一步明確大黃靈仙方的作用靶點(diǎn)，為臨床應(yīng)用奠定其科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選用清潔級健康SD大鼠50只，體質(zhì)量200～250 g。由廣西食品藥品檢驗(yàn)所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號SCXX桂2019-0001。實(shí)驗(yàn)室溫度恒定20～26 ℃，濕度控制40%～70%，飼養(yǎng)環(huán)境為多層層流架，標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，三級過濾純凈水自由飲用。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

1.2 分組標(biāo)準(zhǔn)

所有大鼠隨機(jī)分為5組：空白組、內(nèi)毒素脂多糖(LPS)對照組、LPS+中藥治療組、LPS+信號阻斷劑(PDTC+SB203580)組、LPS+PDTC+SB203580+中藥組，每組大鼠10只。

1.3 方藥制備

由生大黃15 g，威靈仙30 g，芒硝10 g，金錢草30 g，枳殼12 g，雞內(nèi)金10 g，澤蘭15 g，柴胡12 g，郁金12 g，磁石12 g，黃芪30 g，甘草5 g組成，使用中藥配方顆粒劑(由江陰天江藥業(yè)有限公司提供) ，購于廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。

1.4 實(shí)驗(yàn)試劑

6×DNAloading buffer(貨號：RT201-01)、DNA Marker(貨號：RT201-02)均購自天根生化科技(北京)有限公司；PrimeScript TM RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time，RR047A)、TB GreenTM Premix ExTaqTM II(貨號：RR820A)、引物合成均購自日本Takala公司；Trizol(貨號：15596026)購自MRC公司；Mouse Anti-βactin mAb(貨號：TA-09)購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；TLR4 Antibody(貨號：19811-1-AP)、MYD88 Antibody(貨號：23230-1-AP)、HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(貨號：SA00001-2)、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗(貨號：SA00001-1)均購自安諾倫生物科技有限公司；大鼠白介素1β(IL-1β)ELISA Kit(貨號：CSB-E08055r)、大鼠白介素6(IL-6)ELISA Kit(貨號：CSB-E04640r)、大鼠TNF-αELISA Kit(貨號：CSB-E69066r)均購自武漢華美生物工程有限公司；RIPA裂解液(貨號：RR0020)、BCA蛋白濃度測定試劑盒(貨號：PC0020)均購自Solarbio(北京)公司；ECL底物液(貨號：WBKLS0100)購自默克公司。

1.5 實(shí)驗(yàn)方法

1.5.1 造模與給藥

大鼠膽管炎癥模型參考Zhao法[5]進(jìn)行：在大鼠膽總管一次注射5 mg/kg LPS以構(gòu)建肝內(nèi)膽管感染動(dòng)物模型。鑒于動(dòng)物模型的時(shí)效性，中藥給藥擬于造模前 3天開始灌胃給藥，一直延續(xù)至成模后72 h，每天2次，間隔12 h，灌胃液體量為每天2 mL/100 g體質(zhì)量。根據(jù)前期研究結(jié)果[6]，大黃靈仙方給藥劑量為320 mg/(kg·d)，并同時(shí)滿足每天灌胃液體量為2 mL/100 g體質(zhì)量的要求；空白組和LPS對照組及LPS+信號阻斷劑(PDTC+SB203580)組可給予等量蒸餾水代替。PDTC按120 mg/(kg·d)劑量大鼠進(jìn)行腹腔注射，SB203580按照10 mg/(kg·d)大鼠腹腔注射。信號通路阻斷劑每天注射1次，連續(xù)干預(yù)3 d。

1.5.2 標(biāo)本采集

成模后72 h處死各組大鼠，除毛、橫行開腹，大鼠全身肝素化，灌注預(yù)熱，待肝臟變成均一的土黃色，在外科顯微鏡下用牙刷輕柔地將肝實(shí)質(zhì)組織去掉，剩下完整的膽管樹，用于膽管細(xì)胞分離或直接提取蛋白和RNA進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測。

1.6 觀察指標(biāo)與檢測方法

1.6.1 病理切片并HE染色，觀察膽管周圍組織病理性改變

膽管樹分離完成后，切取小部分組織，用0.9%NaCl溶液沖洗，吸干水分后予以4%福爾馬林溶液進(jìn)行固定，脫水石蠟包埋，切片后HE染色，觀察膽管周炎性改變。

1.6.2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測TLR4/MyD88信號通路及下游炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)

在DNA Engine Opticon TM2連續(xù)熒光檢測系統(tǒng) (M J Research公司) 中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。反應(yīng)條件為:95 ℃ 30 s，1 Cycle；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40 Cycles為反應(yīng)條件繪制溶解曲線，檢測TLR4/MyD88信號通路上因子的mRNA表達(dá)量，最終數(shù)據(jù)以2-△△Ct進(jìn)行分析。RT-qPCR實(shí)驗(yàn)過程中所檢測的mRNA表達(dá)水平，都進(jìn)行3個(gè)重復(fù)孔實(shí)驗(yàn)，最后結(jié)果取平均值，3個(gè)重復(fù)孔間CP、Tm數(shù)值相差±0.5，以保證實(shí)驗(yàn)操作穩(wěn)定，數(shù)據(jù)重復(fù)性好，并且真實(shí)可靠。各基因及內(nèi)參基因GAPDH引物采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)(見表1)。

表1 目的基因熒光定量PCR引物序列

1.6.3 WesternBlot檢測TLR4/MyD88信號通路及下游炎癥因子相關(guān)蛋白表達(dá)

提取膽管細(xì)胞總蛋白，再使用MULTISKAN-GO型酶標(biāo)儀(購自Thermo公司)進(jìn)行蛋白質(zhì)定量，SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，使用半干轉(zhuǎn)印儀器(Bio-Rad)將蛋白轉(zhuǎn)印至PVDF膜(15 V，45 min)。轉(zhuǎn)印結(jié)束后，使用5%脫脂乳室溫封閉 PVDF膜1 h；隨后分別4 ℃過夜孵育兔源一抗。過夜孵育后的PVDF膜使用TBST緩沖液洗滌3次，每次5min。隨后室溫孵育HRP標(biāo)記二抗1 h，TBST緩沖液洗滌3次后，采用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影檢測。使用NIH Image J軟件分析各組WB檢測蛋白條帶灰度值，以目的蛋白灰度值與內(nèi)參β-actin灰度值的比例進(jìn)行比較。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果

2.1 各組膽管組織HE染色觀察

結(jié)果顯示，空白組大鼠膽管組織可見膽管細(xì)胞完整、正常，結(jié)構(gòu)清晰，細(xì)胞核大小形態(tài)正常，核仁清晰，胞漿染色均勻，未見細(xì)胞增生，未見炎性細(xì)胞浸潤。LPS組、LPS+ PTDC+SB203580組可見大量膽管細(xì)胞變性、增生，匯管區(qū)大量淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤，膽小管擴(kuò)張淤膽。與之相比，LPS+中藥組、LPS+PTDC+SB203580+中藥組的膽管細(xì)胞變性、增生及膽管內(nèi)炎性細(xì)胞浸潤情況大有改善，極少見細(xì)胞壞死及纖維組織增生，炎性改變基本恢復(fù)正常。各組大鼠膽管組織HE染色病理切片見圖1。

注：a：正常組；b：LPS組；c：LPS+PTDC+SB203580組；d：LPS+中藥組；e：LPS+PTDC+SB203580+中藥組圖1 各組大鼠膽管組織病理變化(HE染色×200)

2.2 各組大鼠膽管組織TLR4/MyD88信號通路及下游炎癥因子相關(guān)基因表達(dá)比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS對照組、LPS+PTDC+SB203580組的TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-αmRNA 表達(dá)，均增加明顯，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS對照組比較， LPS+中藥組、LPS+PTDC+SB203580+中藥組的TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)，則降低明顯，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS+中藥組比較，LPS+PTDC+SB203580+中藥組的TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)，有所降低，但無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表2。

表2 TLR4/MyD88信號通路相關(guān)因子mRNA表達(dá)情況

注：與空白組比較，▲P<0.05；與LPS對照組比較，★P<0.05

2.3 各組大鼠膽管組織TLR4/MyD88信號通路及下游炎癥因子相關(guān)蛋白表達(dá)比較

統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與空白組比較，LPS對照組、LPS+PTDC+SB203580組的TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)，均上升明顯，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而與LPS對照組比較， LPS+中藥組、LPS+PTDC+SB203580+中藥組的TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)，則下降顯著，差異均具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與LPS+中藥組比較，LPS+PTDC+SB203580+中藥組的TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-αmRNA表達(dá)，有所下降，但兩組之間無明顯差異(P>0.05)。結(jié)果見表3。各組大鼠膽管組織TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá)電泳圖見圖2。

表3 TLR4/MyD88信號通路相關(guān)因子蛋白表達(dá)情況

注：與空白組比較，▲P<0.05；與LPS對照組比較，★P<0.05

注：1：正常組；2：LPS組；3：LPS+PTDC+SB203580組；4：LPS+中藥組；5：LPS+PTDC+SB203580+中藥組圖2 各組大鼠膽管組織相關(guān)蛋白電泳圖

3 討論

膽石癥，在中醫(yī)方面可依據(jù)其臨床表現(xiàn)歸屬于“脅痛”“黃疸”等范疇?！鹅`樞·膽經(jīng)》曰：膽，足少陽之脈，是動(dòng)則病口苦，善呔息，心脅痛，不能轉(zhuǎn)側(cè)?！秱摗吩唬骸敖Y(jié)胸實(shí)熱，脈沉而緊，心下痛；按之實(shí)硬，寒熱往來，身黃如桔色”。中醫(yī)認(rèn)為，外感六淫、情志不暢、飲食失節(jié)或蛔蟲上擾，導(dǎo)致肝膽氣機(jī)不暢，肝失疏泄，郁久化熱，濕熱蘊(yùn)蒸于肝膽，與膽汁互結(jié)，日久成石，堵塞于膽道而發(fā)為膽石癥。亦或因久病耗陰、脾胃虛弱，引起精血不足，肝陰不足，疏泄失常，累及膽腑，膽汁通降不暢，久積成石。因此，六腑以通為用，對于膽石癥的治療，疏利肝膽、清熱利濕是主要原則[7]。金錢草、柴胡、雞內(nèi)金、郁金及澤蘭等藥物同奏清熱利濕、疏利肝膽之效，為治療膽石癥的經(jīng)驗(yàn)要藥。中醫(yī)大家朱良春認(rèn)為，肝臟體陰而用陽，慢病日久易耗傷陰血，故治療時(shí)不可一味使用疏肝利膽之藥物，應(yīng)適量加入白芍、黃芪等養(yǎng)陰柔肝、補(bǔ)氣升陽之品[8]。

從現(xiàn)代醫(yī)學(xué)角度而言，膽石癥的發(fā)病機(jī)制與膽道炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[9]。膽管炎癥導(dǎo)致了膽管慢性纖維化、膽道狹窄以及膽汁流體動(dòng)力學(xué)改變，促進(jìn)了膽結(jié)石的形成。膽道炎癥首先表現(xiàn)為膽管內(nèi)表面不平整，逐漸發(fā)展為膽管纖維化，膽管擴(kuò)張或者狹窄，導(dǎo)致膽汁通過時(shí)發(fā)生流體動(dòng)力學(xué)改變，進(jìn)一步引起膽汁淤滯，同時(shí)炎癥導(dǎo)致膽囊收縮功能減弱，膽汁過分濃縮，膽汁中的膽固醇及膽色素呈過度飽和狀態(tài)，沉淀結(jié)晶，從而形成膽道結(jié)石。膽管炎癥生物分子學(xué)機(jī)制研究表明，在膽管細(xì)胞炎性損傷過程中， LPS激活了TLR4/MyD88信號通路加重炎性反應(yīng)引起結(jié)石并導(dǎo)致結(jié)石復(fù)發(fā)率的上升[10]?；诖耍幬镏委熌懯Y通常以削弱炎癥信號通路，減輕炎癥反應(yīng)為主要靶點(diǎn)機(jī)制，從而達(dá)到減少結(jié)石形成為目的。

控制長期慢性膽管炎癥對膽石癥的治療有著至關(guān)重要的作用。大黃靈仙方是廣西中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院肝膽外科治療膽石癥的經(jīng)驗(yàn)要方。從中醫(yī)角度而言，大黃靈仙方契合了膽石癥的病因病機(jī)，重在清熱利濕、疏肝利膽排石。前期實(shí)驗(yàn)研究表明，大黃靈仙方能有效緩解膽道炎癥，改善肝臟膽固醇代謝和膽汁酸代謝，能有效防治膽石癥[11]。

在本研究中，從大黃靈仙方與炎癥信號通路關(guān)系角度出發(fā)，探討大黃靈仙方通過調(diào)控LR4/MyD88信號通路緩解膽道炎癥的具體機(jī)制。研究顯示，LPS對照組大鼠膽管組織病理形態(tài)學(xué)方面較空白組差，膽管組織TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-α基因及蛋白表達(dá)明顯增高，提示經(jīng)LPS誘導(dǎo)后的對照組大鼠其TLR4/MyD88信號通路呈現(xiàn)出高表達(dá)狀態(tài)，大鼠膽管炎癥反應(yīng)明顯。LPS+中藥組、LPS+PTDC+SB203580+中藥組的大鼠在膽管病理組織形態(tài)學(xué)方面較LPS對照組有明顯改善，其膽管組織TLR4、Myd88、IL-1、IL-6、TNF-α基因及蛋白表達(dá)顯著下降，表明了大黃靈仙方能有效調(diào)控膽管炎癥狀態(tài)，其機(jī)制與通過下調(diào)TLR4/MyD88信號通路各節(jié)點(diǎn)分子蛋白相關(guān)。本課題結(jié)果證實(shí)了大黃靈仙方能夠有效改善膽管細(xì)胞病理形態(tài)結(jié)構(gòu)，下調(diào)TLR4/MyD88炎性信號通路的表達(dá)水平，通過抑制TLR4、MyD88的活化，阻斷下游炎癥因子的表達(dá)，修復(fù)膽管損傷，促使膽道恢復(fù)至非炎癥狀態(tài)，從而預(yù)防及治療膽石病。