梨果不同部位中熊果苷的差異分布規(guī)律

李 凡，羅嘉亮，李六林，郝瑞杰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，山西 太谷 030801）

梨屬于薔薇科Rosaceae 梨屬Pyrus植物，在世界各地栽培廣泛，中國(guó)是東方梨的重要原產(chǎn)地之一，種質(zhì)資源十分豐富[1]。梨果實(shí)肉脆多汁，富含糖類、有機(jī)酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酚類物質(zhì)[2]。植物中的酚類物質(zhì)，不僅在植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中涉及許多生理代謝反應(yīng)[3]，還會(huì)直接影響果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[4]和植株的整體抗性[5-6]。袁江等[7]研究發(fā)現(xiàn)，酚類物質(zhì)在不同梨品種間的含量存在很大差 異；Li 等[8]對(duì)我國(guó)8 個(gè)梨品種的酚類物質(zhì)進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，梨果中主要的酚類物質(zhì)是熊果苷；Li 等[9]對(duì)10 個(gè)品種梨的酚類物質(zhì)進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，其果皮與果肉中均存在熊果苷。

熊果苷是當(dāng)今流行的最為安全的美白原料，它能抑制體內(nèi)酪氨酸酶的活性，阻斷多巴及多巴醌的合成，進(jìn)而阻止黑色素的形成[10]。李靜等[11]證實(shí)了熊果苷是對(duì)苯二酚衍生物。梨果具有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘等功用[12-13]，王亞芳等[14]對(duì)小鼠飼喂熊果苷的試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了梨果中具備上述功用的主要物質(zhì)是熊果苷。熊果苷是植物體中重要的次生代謝產(chǎn)物，廣泛存在于多種植物的果實(shí)[15]、花[16]、莖皮[17]、種子[18]等部位中。但是，目前國(guó)內(nèi)外對(duì)梨果中熊果苷的研究尚處于起步階段[19-20]，關(guān)于梨果中熊果苷等酚類物質(zhì)的時(shí)空分布規(guī)律等方面的研究還未深入。為此，本研究以產(chǎn)自山西省太谷縣的栽培梨品種為材料，利用高效液相色譜法，對(duì)不同品種梨果不同部位中熊果苷的含量進(jìn)行了測(cè)定和分析，以期深入了解熊果苷含量在多個(gè)梨品種中的分布差異情況，并闡明熊果苷在梨果中的分布規(guī)律，從而為熊果苷的開(kāi)發(fā)利用提供參考依據(jù)，并為后期梨果中熊果苷代謝機(jī)理的研究及育種實(shí)踐提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

2018年9月在山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所梨種質(zhì)資源圃采集常規(guī)管理的成熟期梨果 實(shí)，供試的5 個(gè)梨品種分別為‘玉露香’‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’，每個(gè)品種各選3 株長(zhǎng)勢(shì)良好的樹(shù)體，在樹(shù)冠外圍各采收3 個(gè)果實(shí)形狀和品質(zhì)均良好的梨果。本試驗(yàn)后續(xù)處理及測(cè)試均在山西農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院進(jìn)行，每處理各設(shè)3 個(gè)重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)藥品及儀器

試驗(yàn)藥品：甲醇、乙腈、甲酸、熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品均為色譜純，其純度均≥99%，均購(gòu)自北京索萊寶公司；濃磷酸為分析純；試驗(yàn)用水為超純水。

試驗(yàn)儀器：U3000 高效液相色譜儀（Thermo LTQ XL），配備四元流動(dòng)相泵、二極管陣列檢測(cè)器（DAD）、熒光檢測(cè)器（FAD）、自動(dòng)進(jìn)樣器、Venusil ASB C18 (250 mm×4.6 mm,5 μm)色譜柱（Agela technologies）；3K30 離心機(jī)（Sigma）；Orion Star A 211 pH 測(cè)量?jī)x（Thermo Scientific）；超聲波清洗儀；電子天平；漩渦振蕩儀。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

取熊果苷標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，加入1 mL 的色譜級(jí)甲醇，配制成20 mg·mL-1的母液。將母液稀釋制備成濃度依次為1 000、500、100、50、30、 10 μg·mL-1的單一標(biāo)準(zhǔn)品溶液（下稱“單標(biāo)”），各吸取1 mL 存入棕色進(jìn)樣瓶中，按照色譜條件依次進(jìn)樣，不使用時(shí)將其保存于-20 ℃的溫度條件下。

1.3.2 果實(shí)部位及果肉切片部位的選取

參照曹玉芬[21]的方法，分別選取果皮、果肉、果心、果肩（果?；浚⒐敚ㄝ嗤莶课唬┑炔课?。

果肉切片部位的選?。喝∪テとズ撕蟮墓?，以果核為中心軸線，圍繞其旋轉(zhuǎn)1 周，依據(jù)梨果膨大程度，按其厚度將果肉均勻劃分為5 個(gè)部分，由果皮至果心的橫向方向依次劃為部位I、部位II、部位III、部位IV 和部位V。梨果肉不同部位的俯視示意圖如圖1 所示。

1.3.3 熊果苷的提取

參照曾少敏等[22]提取酚類物質(zhì)的方法（稍作改進(jìn)）提取熊果苷。分別將梨果各部位以液氮研磨成粉末后，各精確稱取0.6 g置于10 mL的離心管中，于-40 ℃的溫度條件下保存。液相色譜上樣前，在10 mL 的離心管中加入色譜純的純甲醇4.8 mL、超純水1.2 mL，漩渦振蕩充分混勻，常溫超聲15 min后靜置，以5 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速于4 ℃的溫度條件下離心20 min，取上清液過(guò)0.22 μm 的有機(jī)相濾膜，取1 mL 過(guò)濾液存入棕色進(jìn)樣瓶中以待測(cè)。

圖1 梨果果肉不同切片部位的俯視示意圖Fig.1 Overlooking diagram of different parts in pear fruit

1.3.4 高效液相色譜條件的設(shè)定

參照孔祥虹等[23]的方法（稍作改進(jìn)）設(shè)定高效液相色譜條件。流動(dòng)相分別為乙腈（A）和0.5%的甲酸水（B），其梯度洗脫程序見(jiàn)表1。自動(dòng)進(jìn)樣器流速設(shè)為0.8 mL·min-1；柱溫控制為30 ℃；測(cè)定波長(zhǎng)為280 nm，波長(zhǎng)精度為（±0.1）nm；進(jìn)樣量為20 μL，程序運(yùn)行時(shí)間為69 min。

1.4 數(shù)據(jù)處理及分析

分別利用SAS 8.1 和Microsoft Excel 2013 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析和作圖。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（VA∶VB）Table 1 Gradient elution procedure with mobile phases (VA∶VB)

2 結(jié)果與分析

2.1 熊果苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將配制好的濃度梯度分別為10、30、50、100、500、1 000 μg·mL-1的單標(biāo)按照已經(jīng)確立的色譜條件分別進(jìn)樣，根據(jù)色譜圖的結(jié)果選擇熊果苷標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含量的峰面積進(jìn)行線性回歸分析，強(qiáng)制過(guò)原點(diǎn)后得到的熊果苷含量（μg·mL-1）與峰面積的線性方程（y=0.073 7x，R2=0.992 4）如圖2所示。熊果苷的出峰時(shí)間是5.823 min，如圖3 所示。樣品中熊果苷的含量以外標(biāo)法定量，將測(cè)定結(jié)果換算后以每克鮮樣所含熊果苷的微克數(shù)表示，單位為μg·g-1。

圖2 熊果苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 Standard curve of arbutin

2.2 不同品種梨果果皮、果肉、果心中熊果苷的含量分析

對(duì)供試的5 個(gè)梨品種成熟期果實(shí)果皮、果肉、果心中熊果苷的含量進(jìn)行了高效液相色譜分析，結(jié)果如圖4 所示。各品種梨果果皮中熊果苷的含量為171.51 ～872.23 μg·g-1，‘玉 露香’‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果皮中熊果苷的含量分別為872.23、416.19、171.51、289.51、364.45 μg·g-1；各品種間果皮中熊果苷的含量存在差異，‘玉露香’果皮中熊果苷的含量較高，與其它品種間的差異顯著。各品種梨果果肉中熊果苷的含量為2.17 ～12.94 μg·g-1，‘玉露香’‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果肉中熊果苷的含量分別為7.69、2.17、9.18、10.31、 12.94 μg·g-1；各品種間果肉中熊果苷的含量存在差異，‘庫(kù)爾勒’果肉中熊果苷的含量較低，‘庫(kù)爾勒’與‘玉露香’‘黃冠’間其含量差異均不顯著，而與‘豐水’‘鴨梨’間其含量差異均顯著；但‘玉露香’和‘黃冠’之間無(wú)差異，‘豐水’和‘鴨梨’之間也無(wú)差異。各品種梨果果心中熊果苷的含量為74.45 ～268.20 μg·g-1，‘玉露香’‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果心中熊果苷的含量分別為150.93、74.45、130.44、117.87、268.20 μg·g-1；其中，‘鴨梨’果心中熊果苷的含量較高，與其它品種間的含量差異顯著；除‘鴨梨’外，其余品種間的含量無(wú)顯著性差異。由圖4 可知，對(duì)同一品種進(jìn)行橫向比較，果皮、果肉、果心中熊果苷的含量存在顯著性差異，果皮中熊果苷的含量最高，果心次之，果肉中熊果苷的含量最低。果皮與果肉中熊果苷的含量相差較大；在供試的 5 個(gè)品種中，‘庫(kù)爾勒’果皮與果肉中熊果苷的含量差值最大，其果皮中熊果苷的含量是其果肉中的191.79 倍；而‘黃冠’果皮與果肉中熊果苷的含量差值較小，其果皮中熊果苷的含量是其果肉中的18.68 倍；各品種果皮中熊果苷的含量是其果心中的1.31 ～5.78 倍，‘玉露香’的含量倍數(shù)最高，而‘黃冠’的含量倍數(shù)最低。

圖3 熊果苷的色譜圖Fig.3 Chromatogram map of arbutin

圖4 不同品種梨果果皮、果肉、果心中熊果苷的含量比較Fig.4 Comparison of arbutin contents in peel, pulp and core of different cultivars of pear fruits

2.3 不同品種梨果果肩和果頂中熊果苷的含量分析

對(duì)供試的5 個(gè)梨品種成熟期果實(shí)果肩和果頂中熊果苷的含量進(jìn)行了高效液相色譜分析，結(jié)果如圖5 所示。5 個(gè)品種梨果果肩中熊果苷的含量為34.96 ～169.74 μg·g-1，‘玉露香’‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’‘豐水’‘鴨梨’果肩中熊果苷的含量分別為169.74、65.67、34.96、137.40、77.25 μg·g-1； 5 個(gè)品種梨果果頂中熊果苷的含量為35.41 ～ 123.34 μg·g-1，‘玉露香’‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’‘豐 水’‘鴨梨’果頂中熊果苷的含量分別為123.34、73.04、35.41、42.97、94.21 μg·g-1?？v向比較同一品種梨果果肩和果頂中的熊果苷含量后發(fā)現(xiàn)，‘玉露香’和‘豐水’果肩中熊果苷的含量均高于其果頂中的含量，其中，‘玉露香’果肩中的熊果苷含量是其果頂中的1.38 倍，‘豐水’果肩中的熊果苷含量是其果頂中的3.20 倍；而‘庫(kù)爾勒’‘黃冠’和‘鴨梨’果肩中的熊果苷含量均低于其果頂中的含量，其果頂中的熊果苷含量分別是其果肩中的1.11、1.01、1.22 倍。顯著性差異分析結(jié)果表明，‘豐水’果肩和果頂兩個(gè)部位間其熊果苷含量存在差異，除‘豐水’外其余各品種間果肩和果頂中的熊果苷含量均無(wú)顯著性差異。

圖5 不同品種梨果果肩和果頂中熊果苷的含量比較Fig.5 Comparison of arbutin contents in shoulder and top parts of different cultivars of pear fruits

2.4 梨果果肉不同切片部位中熊果苷的含量分析

將供試的5 個(gè)品種成熟期梨果果肉分別切分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ5 個(gè)部位后對(duì)其進(jìn)行高效液相色譜分析，結(jié)果如圖6 所示。‘玉露香’果肉的 5 個(gè)切片部位的熊果苷含量為3.44 ～17.96 μg·g-1， 其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為17.96、3.44、4.43、17.59、9.54 μg·g-1；各個(gè)切片部位間無(wú)顯著性差異?！畮?kù)爾勒’果肉的5 個(gè)切片部位的熊果苷含量 為34.92 ～105.65 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為105.65、58.57、34.92、42.02、67.30 μg·g-1；除Ⅰ與Ⅲ、Ⅳ部位間均有顯著性差異外，其余各個(gè)切片部位間無(wú)顯著性差異?！S冠’果肉的5 個(gè)切片部位的熊果苷含量為16.28 ～46.36 μg·g-1，其 Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為46.36、16.28、20.44、22.39、42.33 μg·g-1；除Ⅰ和 Ⅴ、Ⅱ部位間均有顯著性差異外，其余各個(gè)切片部位間無(wú)顯著性差異?！S水’果肉的5 個(gè)切片部位的熊果苷含量為32.79 ～73.81 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別67.80、32.79、73.81、34.92、37.99 μg·g-1；Ⅲ與Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ部位之間及部位Ⅰ與Ⅱ、Ⅳ部位之間均有顯著性差異，其余各個(gè)切片部位間無(wú)顯著性差異?！喞妗獾? 個(gè)切片部位的熊果苷含量為37.04 ～ 105.47 μg·g-1，其Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ部位的熊果苷含量分別為105.47、73.27、37.04、55.54、53.46 μg·g-1；部位Ⅰ與其余4 個(gè)切片部位之間及部位Ⅱ與Ⅲ之間均有顯著性差異，而其余各個(gè)切片部位間無(wú)顯著性差異。熊果苷在梨果肉內(nèi)廣泛存在，從其各個(gè)切片部位中均可檢測(cè)到，供試的 5 個(gè)梨品種中，‘玉露香’果肉5 個(gè)切片部位的熊果苷含量之間無(wú)顯著性差異，除‘玉露香’外的其余4 個(gè)品種5 個(gè)切片部位間其含量均存在差異，但是，各品種梨果果肉中熊果苷含量較高的切片部位均為部位Ⅰ。

圖6 不同品種梨果果肉不同切片部位的熊果苷含量比較Fig.6 Comparison of arbutin contents in different positions of pear pulp sections from different cultivars

3 結(jié)論與討論

最近幾年有關(guān)熊果苷的研究日益被關(guān)注，因?yàn)樾芄站哂墟?zhèn)咳、美白等功效[24]，是梨果實(shí)中含量較高的酚類物質(zhì)[19]。馬良[25]對(duì)不同梨品種進(jìn)行研究后指出，白梨果實(shí)中酚類物質(zhì)含量最高的是熊果苷；韓凱[26]對(duì)四大系統(tǒng)不同梨品種的熊果苷進(jìn)行測(cè)定后指出，白梨果實(shí)中熊果苷含量普遍較高，而白梨系統(tǒng)不同品種間梨果實(shí)中的熊果苷含量具有顯著性差異；曾少敏等[27]對(duì)不同梨品種的熊果苷進(jìn)行測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，白梨系統(tǒng)果皮中熊果苷的平均含量顯著高于其它系統(tǒng)。本研究結(jié)果表明，供試的5 個(gè)梨品種間其熊果苷含量也存在顯著性差異，屬于白梨系統(tǒng)的‘玉露香’‘庫(kù)爾勒’[28]和‘鴨梨’果皮中的熊果苷含量均顯著高于屬于砂梨系統(tǒng)的‘豐水’果皮中的含量，這與馬良、曾少敏和韓凱的研究結(jié)果均一致。白梨系統(tǒng)的品種是北方主栽梨品種，研究白梨系統(tǒng)對(duì)我國(guó)梨樹(shù)栽培具有重大經(jīng)濟(jì)意義[29]。

張小雙等[30]對(duì)梨果不同部位中的熊果苷進(jìn)行檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，其含量差異顯著；李浩男等[31]在對(duì)梨成熟期果皮的研究中發(fā)現(xiàn)，梨果皮中主要的酚類化合物是熊果苷；Escarpa 等[15]將5 個(gè)西洋梨分為果皮和果肉兩個(gè)部位進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)部位中的熊果苷含量，果皮顯著高于果肉；李麗梅等[32]對(duì)北方主栽梨品種進(jìn)行測(cè)定后指出，3 個(gè)部位中的熊果苷含量，果皮高于果肉和果心。本研究將梨果分為果皮、果肉、果心、果肩、果頂5 個(gè)部位進(jìn)行研究，結(jié)果表明，果皮是熊果苷含量最高的部位，這與張小雙、Escarpa 和李麗梅的研究結(jié)果均一致。研究中還發(fā)現(xiàn)，果皮中熊果苷含量高的梨品種，其果肉和果心中熊果苷的含量相對(duì)較低，如‘玉露香’和‘庫(kù)爾勒’；而果皮中熊果苷含量低的梨品種，其果肉和果心中熊果苷的含量則相對(duì)較高，如‘黃冠’和‘鴨梨’。郭靜等[33]研究指出，熊果苷易溶于水，由此推測(cè)，出現(xiàn)此類結(jié)果的原因可能與熊果苷的運(yùn)輸有關(guān)，熊果苷在梨樹(shù)體內(nèi)合成后，因其溶解性可能會(huì)造成隨著水分的運(yùn)輸而表現(xiàn)出分布不均勻的現(xiàn)象。供試的果肉、果肩、果頂同為去皮去核的梨果肉，比較同一品種這3 個(gè)部位中的熊果苷含量可發(fā)現(xiàn)，果肉較果肩和果頂?shù)?，結(jié)合熊果苷含量最高的部位是梨果皮這一結(jié)果可以推測(cè)，由于梨果皮存在的蒸發(fā)現(xiàn)象[34]，所以存在于梨果實(shí)內(nèi)的熊果苷，更有可能向梨果外緣富集，因此，同在外緣區(qū)域的果肩、果頂也有可能都會(huì)出現(xiàn)熊果苷含量較高的現(xiàn)象。

對(duì)供試的5 個(gè)梨品種果肉的5 個(gè)切片部位進(jìn)行了高效液相色譜分析，研究了熊果苷在梨果肉中的分布規(guī)律。結(jié)果表明，‘玉露香’梨果果肉 5 個(gè)切片部位間其熊果苷含量無(wú)顯著性差異，即熊果苷在‘玉露香’梨果肉中的分布均勻。不同于果皮與果心的是，梨果肉屬于結(jié)構(gòu)相似的薄壁組織[35]，梨果在膨大期通過(guò)快速吸水以實(shí)現(xiàn)體積重量的增大[36]，這種結(jié)構(gòu)相似的均一性與熊果苷在梨果肉內(nèi)分布均勻之間存在著直接的關(guān)系，但是，目前梨果內(nèi)熊果苷的生物合成仍未得到闡明。除‘玉露香’外，其余4 個(gè)梨品種熊果苷含量較高的切片部位均為部位Ⅰ，因?yàn)椴课虎窨拷?，可能受到了果皮中熊果苷含量高的影響?/p>

熊果苷廣泛存在于梨果內(nèi)，供試的5 個(gè)梨品種均富含熊果苷這一酚類物質(zhì)，且各品種間其含量存在差異，‘玉露香’梨果中的熊果苷含量最高；同一品種各部位間其含量也存在差異：橫向比較可知，果皮中的熊果苷含量最高，果心次之，果肉最低；縱向比較可知，果肩和果頂中的熊果苷含量相近。對(duì)梨果肉的切片分析結(jié)果表明：‘玉露香’梨果肉5 個(gè)切片部位間其熊果苷含量無(wú)明顯差異，說(shuō)明熊果苷在其果肉中的分布均勻且不同切片部位間其含量相差較??；除‘玉露香’外的其余梨品種，熊果苷含量最高的切片部位均為靠近果皮的位置?？傊芄盏亩喾N功效及其在植物中的廣泛存在值得在生產(chǎn)中加以開(kāi)發(fā)和利用。本研究闡明了成熟期梨果不同部位中熊果苷的差異分布規(guī)律，后續(xù)研究將進(jìn)一步探尋不同生育期梨果內(nèi)熊果苷含量的節(jié)律變化特點(diǎn)，并結(jié)合梨果實(shí)發(fā)育轉(zhuǎn)錄組學(xué)，揭示熊果苷的生物合成及富集機(jī)理。