恒溫擴增技術在肺結核診斷中的應用價值

陳怡文 張臘紅 洪理泉 陳菊萍 唐磊明 陳兆軍

結核病是由結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis，MTB）感染所致，是以呼吸系統(tǒng)感染為主的慢性傳染病。世界衛(wèi)生組織對于結核病最新報道顯示目前全球約有1/3人感染過MTB，2015年全球新發(fā)病例1 040多萬，約140萬人死于結核病，我國結核患者數(shù)量居全球第三位[1]。目前傳統(tǒng)的結核檢測方法如標本直接涂片抗酸染色鏡檢、分離培養(yǎng)鑒定等均無法滿足快速診斷的要求，采用BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)對涂片陽性痰液標本進行檢測也需要7～10d才能完成[2]，檢測周期長，不能滿足臨床快速診斷結核病及其防治的需求。分子檢測手段能夠提高臨床肺結核的診斷率。臨床目前常用GeneXpert MTB是全自動一體化熒光定量PCR儀專用的MTB檢測試劑盒，檢測靈敏度和特異度高于現(xiàn)有檢測方法[3]，也是目前WHO推薦使用的分子檢測方法。近年來，恒溫擴增技術（simultaneous amplification and testing，SAT）作為新一代核酸擴增檢測技術，其靈敏度遠高于其它核酸檢測技術，已廣泛用于病原體檢測領域[4-5]，特別在涂片陰性痰液標本中有較高的陽性率，可以降低肺結核臨床誤診率。本研究采用SAT、GeneXpert MTB和快速液體培養(yǎng)系統(tǒng)對肺結核和其他呼吸系統(tǒng)疾病患者的同一份痰液樣本進行MTB檢測，比較3種方法學的差異，評估SAT在肺結核快速診斷中的價值。

1 材料和方法

1.1 樣本來源 選取2016年1月至10月在杭州師范大學附屬醫(yī)院結核科就診的可疑初治肺結核患者108例，男76例，女32例，年齡35～65歲，平均44歲。并選取同期呼吸科非肺結核呼吸道疾病患者15例作為對照組，男10例，女5例，年齡24～65歲，平均44歲。最終108例可疑肺結核患者中，確診為肺結核患者102例，非MTB感染者6例，診斷標準參考2010年世界衛(wèi)生組織發(fā)布的“結核診斷與治療指南”[7]。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

1.2 儀器與試劑 BACTECTMMGITTM960 System全自動分枝桿菌檢測系統(tǒng)（美國BD公司），GeneXpert擴增檢測儀（美國Cepheid公司），分枝桿菌超聲破碎儀、恒溫混勻儀（上海仁度生物科技有限公司），ABI7500型熒光定量PCR儀（美國應用生物系統(tǒng)公司），離心機（美國Thermo Fisher公司），抗酸染色液（珠海貝索生物技術有限公司），SAT試劑盒（上海仁度生物科技有限公司），GeneXpert MTB檢測試劑盒（美國Cepheid公司）。

1.3 標本采集及前處理 采集患者清晨痰液，參照《結核病診斷實驗室檢驗規(guī)程》的方法[6]，于采集2h內將痰液標本直接進行抗酸染色鏡檢，再進行前處理后分別進行SAT、GeneXpert MTB和快速液體培養(yǎng)。前處理過程：挑取約5ml痰液，加入2倍的2%NALC-NaOH前處理液，強力漩渦振蕩20s；室溫靜置15～20min；加入無菌磷酸鹽緩沖液（PBS，pH 6.8） 至約 50ml，蓋緊蓋子；3 000g 離心15min，棄上清液；添加 1～3ml PBS（pH 6.8），混勻備用。

1.4 痰直接抗酸染色鏡檢 挑取標本有干酪樣、膿樣或可疑部分涂片，抗酸染色后鏡檢報告結果。

1.5 SAT檢測 將前處理后的痰液進行如下操作：（1）RNA提?。喝∏疤幚砗蟮奶狄?ml于樣品處理管中，13 000g離心5min，棄上清液，加入50μl TB稀釋液，充分振蕩混勻，即制成待測樣本；將待測樣本和50μl制備好的陽性及陰性對照放入分枝桿菌破碎儀內，功率為300W的超聲處理15min后，13 000g離心5min，上清液即為提取的RNA。（2）擴增：將2μl RNA提取物加入30μl擴增檢測液的微量反應管中，置于恒溫混勻儀上60℃ 10min，42℃ 5min后向反應管中加入10μl已 42℃預熱的酶液，立即蓋上管蓋振蕩15s混勻。（3）檢測：將微量反應管快速置于ABI 7500熒光定量PCR儀內，程序設置（選取FAM通道；42℃ 1min，40個循環(huán)；每分鐘采1次熒光，共40次；反應體系42μl），立即運行擴增程序。（4）結果判斷：樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(shù)（Ct）≤35的樣本為陽性，35＜Ct＜40需復查，結果Ct＜40為陽性，Ct為40或無數(shù)值為陰性。

1.6 BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng) 取前處理好的痰標本0.5ml接種至MGIT培養(yǎng)管中，放入BACTECTMMGITTM960 system進行培養(yǎng)；培養(yǎng)陽性標本送至杭州疾病控制中心進行菌種鑒定。

1.7 GeneXpert MTB檢測 取處理好痰液1ml加入收集管中，加入相當于2倍痰液體積的處理液，旋緊管口，渦旋震蕩15～30s，室溫培養(yǎng)15min。打開檢測盒，取2ml處理后的樣本由加樣孔緩慢加入檢測盒內，然后將檢測盒放置到檢測模塊，儀器開始自動檢測，反應結束后，在檢測系統(tǒng)窗口下直接觀察結果。

1.8 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件。以臨床診斷為對照，分別計算SAT、GeneXpert MTB法和BACTECTMMGITTM960 System檢測MTB的陽性率、靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值，不同檢測方法結果的比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

108例疑似肺結核患者痰樣本經(jīng)檢測，SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)檢測MTB的陽性率分別為 62.0%（67/108）、64.8%（70/108）和 50.0%（54/108）。經(jīng)χ2檢驗，快速液體培養(yǎng)法的陽性率分別與SAT和GeneXpert MTB 法比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=4.4、7.5，均 P＜0.05）；SAT 法的陽性率與 GeneXpert MTB 法比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.2，P ＞0.05）。

以臨床診斷為標準，SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)對MTB檢測的靈敏度分別為65.7%（67/102）、68.6%（70/102）和 47.1%（48/102）；特異度分別為 100%（21/21）、100%（21/21）和 71.4%（15/21）；陽性預測值分別為 100%（67/67）、100%（70/70）和 88.9%（48/54）；陰性預測值分別為 37.5%（21/56）、39.6%（21/53）和 21.7%（15/69）。經(jīng)χ2檢驗，快速液體培養(yǎng)法的靈敏度分別與SAT和GeneXpert MTB法比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=12.0、18.38，均 P＜0.05）；SAT 法的靈敏度與 GeneXpert MTB 法比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=3.2，P＞ 0.05）。

涂片陽性樣本中，SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)的靈敏度分別為 89.1%（49/55）、89.1%（49/55）和83.6%（46/55），3者靈敏度差異無統(tǒng)計學意義。涂片陰性標本中SAT、GeneXpert MTB法和快速液體培養(yǎng)的靈敏度分別為 38.3%（19/47）、44.7%（21/47）和 4.3%（2/47），經(jīng)χ2檢驗，快速液體培養(yǎng)法的靈敏度分別與SAT和GeneXpert MTB法比較，差異均有統(tǒng)計學意義（χ2=16.3、21.8，均 P＜0.05）；SAT 法的靈敏度與 GeneXpert MTB 法比較，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=0.39，P ＞0.05）。見表1。

3 討論

MTB的感染已經(jīng)成為嚴重的公共衛(wèi)生問題。傳統(tǒng)的MTB檢測方法是抗酸染色及金標準細菌培養(yǎng)加鑒定[8-9]，然而這些方法靈敏度低且需要菌量大，檢測周期長，這可能使得結核病患者無法快速診斷而錯過最佳治療時間，如何快速檢測出MTB，以供臨床早期診斷，一直是結核病研究的重要課題。

目前GeneXpert MTB作為WHO推薦使用的分子檢測MTB的方法在臨床開始使用，其是基于檢測靶核酸為DNA的全自動一體化熒光定量PCR，能在2h內從患者新鮮痰液中直接檢出是否含有MTB，檢測靈敏度和特異度均很高。但目前在中國GeneXpert MTB檢測結核及其利福平耐藥的費用較高，且臨床收費暫未進入患者醫(yī)保，因此難于廣泛應用于臨床。

本研究選取了同樣具有高靈敏度和特異度的SAT法對疑似肺結核患者痰液進行檢測，結果顯示SAT和GeneXpert MTB法對疑似肺結核患者痰標本檢測的陽性率、靈敏度和特異度均明顯高于BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法，結果與Cui等[10]研究得出的SAT靈敏度和特異度均優(yōu)于BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法的結論相符。SAT與GeneXpert MTB法在涂陰的樣本中的檢出率也明顯高于BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法，降低了臨床對肺結核的誤診率。

表1 SAT、GeneXpert和MGIT 960在臨床診斷中的方法學比較

SAT法的原理是通過特異性的MTB核糖體RNA擴增引物及優(yōu)化探針技術，使用M-MLV反轉錄酶及極高轉錄活性的T7 RNA多聚酶同時實現(xiàn)核酸恒溫擴增和實時熒光檢測。此技術檢測周期明顯縮短，僅需4h即可完成檢測，并且能特異性檢測MTB，相比BACTECTMMGITTM960快速液體培養(yǎng)法檢測時間進一步縮短，且彌補了培養(yǎng)法無法鑒別結核與非MTB的缺陷。本實驗樣本中臨床診斷為非MTB感染者的痰液有6例，均為BACTECTMMGITTM960培養(yǎng)法檢測陽性，而SAT檢測為陰性，進一步證實了SAT法能特異性檢測MTB。應用于臨床可以提示醫(yī)生對于痰培養(yǎng)陽性而SAT法為陰性結果的患者是否可能考慮為非MTB感染[11]。

另外SAT與GeneXpert MTB相比，GeneXpert MTB檢測核酸類型為DNA，由于操作不當易引發(fā)實驗室內交叉污染，且無法區(qū)別活菌與死菌[12-13]。而SAT檢測核酸類型為RNA，只在活菌中存在，在環(huán)境中極易降解，可作為活動性結核診斷及藥物療效監(jiān)測的方法，并且能減少實驗室污染和假陽性率[14]。當然SAT法也有一定的缺點，本次實驗結果中確診為肺結核患者的樣本中有4例涂陽培陽樣本經(jīng)SAT檢測結果為陰性，可能的原因是此樣本中存在RNA酶抑制劑、MTB量少或者檢測懸液分布不均等原因[14]。但是SAT法總體假陰性率比較BACTECTMMGITTM960液體培養(yǎng)法已經(jīng)明顯減低。

綜上所述，SAT與世界衛(wèi)生組織推薦使用的分子診斷技術GeneXpert MTB同樣都擁有較高的靈敏度、特異度和陽性率，甚至有優(yōu)于它的特點；應用SAT技術僅需4h即可檢測MTB活菌，提高了臨床上肺結核快速診斷的準確率及靈敏度，對肺結核快速診斷有重要的價值，值得進一步臨床推廣和應用。