水蜜桃酒速釀酵母菌的篩選、鑒定及發(fā)酵條件優(yōu)化

劉沁源 吳祖芳 翁佩芳

(寧波大學食品與藥學學院,浙江 寧波 315800)

水蜜桃(Prunus persica)肉質(zhì)細軟、汁多味甜、營養(yǎng)豐富,其中奉化水蜜桃品質(zhì)最為優(yōu)異,被譽為“瓊漿玉露”、“瑤池珍品”[1-2]。水蜜桃是呼吸躍變型水果,耐儲性差,易腐爛,一般以鮮食為主,上市時間集中于5-9月,往往因不能及時銷售和加工造成大量浪費,嚴重影響我國水蜜桃果業(yè)的發(fā)展[3-4]。要解決這個問題,必須改變傳統(tǒng)水果的消費觀念,改變水蜜桃食用途徑與模式[5-6]。水蜜桃酒正是一種理想的消費轉(zhuǎn)換方式[7-8]。

果酒生產(chǎn)過程中酵母菌起關(guān)鍵性作用,其發(fā)酵力的好壞,影響酒的產(chǎn)量、副產(chǎn)物的量、發(fā)酵周期及產(chǎn)品風味,具有重要的研究應(yīng)用價值[9-11]。目前果酒生產(chǎn)中所用酵母菌大多為葡萄酒用酵母,這種酵母菌是針對葡萄酒生產(chǎn)工藝特點而開發(fā)的,應(yīng)用于其他果酒的釀造難以形成良好風味,不能滿足消費者需求[12]。少數(shù)針對桃子酒釀造酵母的研究尚處初步階段,李澤霞等[9]從感官質(zhì)量、發(fā)酵特性、產(chǎn)酒能力3 個方面進行綜合評價,選育了1 株優(yōu)良的蜜桃酒釀造菌種HJ2-1；蔣錫龍等[13]通過杜氏管發(fā)酵法、耐受性試驗、發(fā)酵性能測定馴化選育了1 株產(chǎn)酒能力達到釀酒要求的酵母J11,但上述研究均缺少發(fā)酵風味方面的桃酒酵母菌篩選工作,若將風味分析應(yīng)用于菌種篩選,可為提高發(fā)酵液口感與品質(zhì)提供一定的指導。同時,在果酒產(chǎn)業(yè)化釀造中,發(fā)酵性能好的菌種能縮短主發(fā)酵周期,節(jié)約能耗,提高設(shè)備利用率[13]。因此,針對水蜜桃發(fā)酵酒的生產(chǎn)特點,開發(fā)出優(yōu)質(zhì)高效的發(fā)酵菌種非常必要[14-16]。

本研究將基礎(chǔ)菌種的篩選步驟與頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(headspace soid-phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GCMS)分析技術(shù)相結(jié)合,從水蜜桃自然發(fā)酵醪中分離篩選能快速釀造水蜜桃酒的專用酵母菌,并對其發(fā)酵工藝進行響應(yīng)面優(yōu)化,使發(fā)酵菌種在最適發(fā)酵條件下釀造得到優(yōu)質(zhì)水蜜桃酒,旨在為水蜜桃酒的研究與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原材料：玉露水蜜桃,采摘于浙江省寧波市奉化區(qū)種植基地。

商業(yè)化釀酒酵母：安琪牌葡萄酒活性干酵母(angel brand grape wine active dry yeast,NQ,經(jīng)鑒定為酵母屬釀酒酵母菌),安琪酵母股份有限公司提供。

試劑：酵母浸出粉胨葡萄糖(yeast extract peptone dextrose,YPD)培養(yǎng)基、煌綠乳糖膽鹽肉湯、平板計數(shù)瓊脂,杭州微生物試劑有限公司；果膠酶(500 U·mg-1),源葉生物科技有限公司；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrazolium chloride,TTC)顯色劑,北京索萊寶科技有限公司；Megazyme 乙醇檢測試劑盒,上海仁捷生物科技有限公司；3,5-二硝基水楊酸、酒石酸鉀鈉、苯酚、無水亞硫酸鈉、葡萄糖、氫氧化鈉、偏亞硫酸鉀、氯化鈉均為分析純,國藥集團化學試劑有限公司；無水檸檬酸(食品級),江蘇科倫多食品配料有限公司；白砂糖,購于當?shù)厥袌觥?/p>

1.2 主要儀器與設(shè)備

7890B-7000C GC-MS 聯(lián)用儀,美國Agilent 公司；SpectraMax190 酶標儀,美谷分子儀器(上海)有限公司；SW-CJ-2D 型雙人單面凈化工作臺,蘇州凈化設(shè)備有限公司；UV-3300 紫外分光光度計,上海美譜達儀器有限公司；WYT-IV 手持式折光儀,廣州滬瑞明儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌種分離 將新鮮水蜜桃打漿,置于250 mL三角瓶中,覆上三層紗布,于28℃自然發(fā)酵3～7 d,當有大量氣泡產(chǎn)生時,取適量發(fā)酵醪稀釋涂布于YPD 固體培養(yǎng)基,28℃放置2～3 d,從中分離不同形態(tài)的菌株。典型的酵母菌菌落表面光滑、濕潤、黏稠,易挑起,多為乳白或奶油色,有酒香味。將分離所得具有初步酵母形態(tài)的菌株劃線分離純化[16-18]。

1.3.2 菌種初篩 TTC 顯色法參照王梅等[19]的方法,產(chǎn)酒精度越高的菌株,與TTC 反應(yīng)顯色越深,由菌落呈色深淺來判定菌株產(chǎn)酒精能力,挑選菌落呈紅色的菌株作為優(yōu)選菌株。

杜氏小管法：在同等條件下,將TTC 顯色法優(yōu)選的菌株分別接入水蜜桃果汁,28℃培養(yǎng)48 h,每隔一段時間觀察杜氏小管中產(chǎn)氣情況。初步判斷釀酒酵母的發(fā)酵能力和絮凝能力,進一步篩出性狀良好的酵母菌株[20]。

1.3.3 菌種一級復篩(不同菌株耐酒精能力) 將活化后的初篩優(yōu)選菌株接入酒精度分別為6、8、10、12、14 和16% vol 的YPD 液體培養(yǎng)基中,28℃條件下?lián)u床培養(yǎng)24 h,在600 nm 波長處測定吸光度值,通過比較各菌懸液的吸光度值篩選出耐酒精性能較強的菌株[21-22]。

1.3.4 菌種二級復篩(不同菌株發(fā)酵速度與產(chǎn)酒能力) 水蜜桃酒釀造工藝流程[23-24]：桃子清洗→去核打漿→80 mg·L-1偏亞硫酸鉀抑菌護色→果膠酶酶解→過濾→成分調(diào)整→巴氏滅菌→接種酵母菌→主發(fā)酵→后發(fā)酵→下膠處理→滅菌→陳釀→灌裝→成品。

將上述一級復篩的優(yōu)選菌株與NQ(用無菌溫水浸泡后接于YPD 培養(yǎng)基中活化,并于試管斜面保存)均按5%(種子液菌體濃度約為5.0×106CFU·mL-1)的接種量分別接入桃汁,28℃發(fā)酵7 d,測定發(fā)酵液各理化指標。

1.3.5 菌種三級復篩(GC-MS 分析發(fā)酵液揮發(fā)性風味與感官評定) 取主發(fā)酵結(jié)束后的水蜜桃酒5 mL于頂空瓶中,加1.4 g 氯化鈉,將酒樣置于60℃條件下平衡15 min。將老化后的固相微萃取頭插入頂空瓶中,60℃萃取30 min,插入GC-MS 進樣器,210℃解吸7 min。

色譜條件：毛細管柱為Vocal(60 m×0.32 mm×1.8 μm)。程序升溫條件：初始溫度35℃,保持3 min,以3℃·min-1升至40℃,保持1 min,再以5℃·min-1升至200℃,保持20 min。

質(zhì)譜條件：采用全掃描模式采集信號,掃描質(zhì)量范圍m/z 40～600,掃描頻率3.6 scans·s-1；離子源EI,70 eV,230℃；四級桿溫度150℃；接口溫度220℃。

定性分析：將質(zhì)譜圖經(jīng)NIST 14 Library 譜庫檢索。選擇較高匹配度的檢索結(jié)果,按面積歸一化法進行定量分析,求得不同酵母菌發(fā)酵果酒中揮發(fā)性風味成分相對百分含量。

感官評定：參考NY/T 1508-2017[25],由8 位經(jīng)驗豐富的感官品評員(男女各4 名)對水蜜桃酒進行評價,品評員根據(jù)水蜜桃酒外觀、香氣、滋味、典型性進行打分,具體證分標準見表1。

1.3.6 菌種分子生物學鑒定 利用通用引物NL1(5′-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3′)與NL4(5′-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3′),以酵母菌基因組為模板,擴增26S rDNA D1/D2 區(qū)序列,將其克隆到載體中再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細胞,篩選陽性克隆提交至生工生物工程(上海)股份有限公司測序[8]。將測定的序列提交至GenBank 數(shù)據(jù)庫,使用BLAST 程序與已有菌株的26S rDNA D1/D2 區(qū)序列進行相似性比較,確定該菌株的分類地位。

1.3.7 單因素工藝優(yōu)化 調(diào)節(jié)水蜜桃果汁初始糖度為22°Brix,用食品級無水檸檬酸調(diào)節(jié)水蜜桃汁初始pH 值分別為3.0、3.5、4.0、4.5 和5.0(自然狀態(tài)下完全成熟的水蜜桃pH 值約為5.0,該pH 下所釀水蜜桃酒口味平淡),添加酵母量為5%,置于28℃條件下發(fā)酵5 d,測定發(fā)酵液酒精度,進行感官評價；以上述最優(yōu)pH 值為基礎(chǔ),在水蜜桃果汁中添加接種量分別為3%、5%、7%、9%和11%的酵母菌,置于28℃條件下發(fā)酵5 d,測定發(fā)酵液酒精度,進行感官評價；在最優(yōu)pH值,最佳接種量的基礎(chǔ)上,將發(fā)酵液分別置于24、26、28、30 和32℃的培養(yǎng)箱中放置5 d,測定發(fā)酵液酒精度,進行感官評價。

1.3.8 響應(yīng)面工藝優(yōu)化 水蜜桃酒響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平見表2。

表1 水蜜桃酒感官評定標準Table 1 Sensory evaluation criterion of peach wine

表2 Box-Behnken 響應(yīng)面試驗設(shè)計因素水平Table 2 Vairables and levels in Box-Behnken experimental design

1.3.9 理化指標測定 可溶性固形物：手持式折光儀測定；酒精度：Megazyme 乙醇檢測試劑盒法測定；總糖、還原糖：DNS 比色法測定[26]；總酸、干浸出物：參考GB/T 15038-2006 測 定[27]；菌落總數(shù)：參考GB 4789.2-2016 檢測[28]；大腸菌群數(shù)：參考GB 4789.3-2016 檢測[29]；

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗均進行3 次生物學重復。采用Origin 2017 軟件作圖,采用SPSS 25.0 軟件進行單因素方差分析(One-way ANOVA)與鄧肯法(Duncan’s)差異分析,P＜0.05 表示有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌種分離

從有大量氣泡的水蜜桃發(fā)酵醪中共分離出38 株不同形態(tài)的菌株,觀察菌株菌落形態(tài)與顯微形態(tài),純化分離出10 株具有初步酵母形態(tài)且菌落特征有差異的菌株,依次編號為PY01～PY10,菌株基本特征如表3所示。

2.2 菌種初篩

2.2.1 TTC 顯色法 將上述10 株菌株進行TTC 顯色試驗。由表4可知,PY03 與PY07 菌落顏色不變,表明其不產(chǎn)酒精；其他8 株菌落呈紅色,表明這8 株菌株具備產(chǎn)酒精能力。根據(jù)呈色深淺,說明PY01、PY05、PY09 產(chǎn)酒精能力較強。

表3 分離菌株菌落及細胞形態(tài)特征Table 3 Colony and cell morphology of isolated strains

表4 不同菌株TTC 顯色效果Table 4 TTC color rendering effect of different strains

2.2.2 杜氏小管法 將上述8 株具備產(chǎn)酒精能力的菌株接入杜氏小管進行產(chǎn)氣能力測試。由表5可知,PY01、PY05 發(fā)酵速度最快,發(fā)酵12 h 產(chǎn)氣量可充滿整個杜氏小管,其中PY01 起酵速度最快,第6 小時開始發(fā)酵產(chǎn)氣。28℃發(fā)酵48 h 產(chǎn)氣量能充滿整個杜氏小管的菌株有6 株,分別為PY01、PY02、PY04、PY05、PY06 和PY09,將這6 株菌株作為復篩的出發(fā)菌株。

表5 不同菌株杜氏小管產(chǎn)氣效果Table 5 Gas production effect of Durham tube of different strains

2.3 菌種一級復篩

將上述6 株菌株接種到不同酒精度的YPD 液體培養(yǎng)基中。由圖1可知,PY01 對酒精的耐受能力最強,最高可耐受12% vol 的酒精度；其次是PY05,最高可耐受10% vol 的酒精度；PY02 與PY06 對酒精的耐受力均為8% vol；PY04 與PY09 的酒精耐受力最差,僅可以耐受6% vol 的酒精度。一般果酒的酒精度可達到10～12% vol,因此選擇PY01 與PY05 作為二級復篩的出發(fā)菌株。

圖1 不同菌株對酒精的耐受能力Fig.1 Alcohol tolerance of different strains

2.4 菌種二級復篩

調(diào)節(jié)水蜜桃汁初始糖度為22°Brix,總糖含量為190 g·L-1,總酸含量為6.7 g·L-1,pH 值為3.5,將PY01、PY05 與NQ 均按照5%接種量分別接入桃汁,置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵,定期測定發(fā)酵液的酒精度及總糖含量。由圖2可知,3 種酵母菌在發(fā)酵過程中總糖、酒精度的動態(tài)變化在第5 天后趨于穩(wěn)定,表明3 種酵母菌均可在發(fā)酵第5 天完成主發(fā)酵；PY01、PY05 與NQ 主發(fā)酵結(jié)束后酒中殘?zhí)呛烤陀?0 g·L-1,酒精度分別為11.67、10.43 和10.67% vol,可知篩選出的PY01 和PY05 菌株的發(fā)酵速度與產(chǎn)酒能力與NQ 相當,可在5 d 內(nèi)快速釀造水蜜桃酒。

2.5 菌種三級復篩

由表6可知,3 種不同酵母菌發(fā)酵酒中共檢出45種揮發(fā)性成分,主要包括酯類25 種、醇類8 種、酮和醛類3 種、酸類5 種、其他類4 種。其中含量較高的揮發(fā)性物質(zhì)為辛酸乙酯、癸酸乙酯、月桂酸乙酯、乙酸乙酯、苯乙醇、桃醛。PY01、PY05 和NQ 3 種酵母菌發(fā)酵酒中揮發(fā)性風味成分的種類與含量存在較大差異,其中酯類物質(zhì)種類分別為18、11、13 種,相對含量分別為83.593%、75.839%、69.990%。PY01 發(fā)酵酒的酯類種類最為豐富,相對含量也最高,主要歸因于癸酸乙酯、月桂酸已酯和辛酸乙酯的高產(chǎn)。癸酸乙酯賦予果酒蜜香,月桂酸乙酯賦予果酒花香,而辛酸乙酯賦予果酒酒香果香以及白蘭地的香韻[30]。因此,PY01 發(fā)酵酒比PY05 和NQ 發(fā)酵酒呈現(xiàn)出更豐富的風味層次。醇類物質(zhì)種類及其相對含量也是影響果酒風味的主要原因[31],PY01 和NQ 發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)較豐富,均為7種,PY05 發(fā)酵酒中醇類物質(zhì)為4 種。其中含量較多的醇類物質(zhì)為二氫-β-紫羅蘭醇和苯乙醇,這2 種物質(zhì)均為國標允許使用的食用香料,二氫-β-紫羅蘭醇具有溫柔的紫羅蘭花香,苯乙醇具有玫瑰花香[32-33],均賦予果酒濃郁的風味。由醇類物質(zhì)分析結(jié)果可知,PY01 和NQ 菌株發(fā)酵酒優(yōu)于PY05。在3 種菌株發(fā)酵酒中醛酮類物質(zhì)共有3 種,其中桃醛具有強烈的桃子香氣,在3 種菌株果酒中含量均較高,賦予水蜜桃酒香甜醇厚的典型性。甲酸、乙酸是3 種菌株發(fā)酵酒中共有的酸味物質(zhì),賦予果酒酸味,但己酸、正癸酸會產(chǎn)生腐敗酸臭味,其中正癸酸為NQ 酵母發(fā)酵酒所特有,賦予水蜜桃酒不愉快的風味[33]。

圖2 3 種酵母菌發(fā)酵過程中總糖、酒精度的變化Fig.2 Changes in total sugar and alcohol content during fermentation of three species of yeast strains

由表7可知,PY01 發(fā)酵的水蜜桃酒微黃透明、桃香濃郁、口感醇厚、酸甜適中、無苦澀味、具有桃酒應(yīng)有的特征與風味,綜合評分為88.6 分；PY05 發(fā)酵的水蜜桃酒酸味較大、有苦澀味,在香氣方面與感官評分上也遠遠低于PY01；NQ 發(fā)酵的水蜜桃酒帶有令人難以接受的苦澀味,桃香清淡,不具有水蜜桃酒應(yīng)有的特征與風味,感官評分最低。綜合3 株酵母菌GC-MS 風味分析和感官品評結(jié)果,PY01 優(yōu)于PY05 和NQ,最終選擇PY01 菌株作為快速釀造水蜜桃酒的專用酵母菌。

表6 3 種酵母菌發(fā)酵水蜜桃酒主要香氣成分分析Table 6 Analysis of main aroma components in peach wine fermented by three species of yeast strains

表6(續(xù))

表7 3 種酵母菌發(fā)酵水蜜桃酒感官品評結(jié)果Table 7 Sensory evaluation results of 3 species of yeast strains fermented peach wine

2.6 菌種分子生物學鑒定

PY01 菌株26S rDNA D1/D2 區(qū)序列擴增電泳圖,如圖3所示,序列長度為593 bp。將此序列在NCBI 中進行BLAST 比對,PY01 菌株與釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)一些種屬的26S rDNA 序列相似度達到100%,鑒定PY01 為酵母屬釀酒酵母菌。

2.7 發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.7.1 單因素試驗 果酒發(fā)酵過程中發(fā)酵條件的控制直接影響果酒的品質(zhì)與風味[34-36]。由圖4-A可知,當初始pH 值為4.0 時,發(fā)酵5 d 后水蜜桃酒酒精度最高,為11.33% vol,感官評分也最高。pH 值過低或過高,會導致酵母蛋白變性、細胞死亡或分解,最終影響發(fā)酵速率[3]。且初始pH 值過低,水蜜桃酒顏色渾濁,口感偏酸；初始pH 值過高,水蜜桃酒滋味平淡,均影響果酒的風味與品質(zhì)。

由圖4-B可知,當主發(fā)酵溫度從24℃升至26℃,酒精度也逐漸增加,26℃達到最大值(11.42% vol),感官評分也最高。當主發(fā)酵溫度繼續(xù)升高時,酒精度逐漸降低,說明溫度過高不利于酵母菌產(chǎn)酒精,且過快的發(fā)酵速度難以形成良好的果酒風味[7]。

由圖4-C可知,當PY01 菌株的接種量為7%時,酒精度最高,達到11.28% vol,感官評分也維持在較高水平。繼續(xù)增加接種量,酒精度反而下降,說明過高的酵母量不利于酒精的發(fā)酵,這可能是由于當酵母量過高,用于酵母自身生長的糖類等營養(yǎng)物質(zhì)增多,而用于酒精發(fā)酵的營養(yǎng)物質(zhì)減少；若接種量過大,果酒渾濁、有酵母的味道,發(fā)苦,風味與品質(zhì)會嚴重下降[37-38]。

2.7.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果分析 利用Design Expert 8.0.6 軟件對因素水平進行二次多元回歸分析,各試驗影響因子初始pH 值(X1)、主發(fā)酵溫度(X2)、酵母接種量(X3)對酒精度(Y)的影響可用回歸方程表示：Y＝12.38 - 0.44X1- 0.19X2- 0.72X3＋0.35X1X3＋。

圖3 PY01 菌株26S rDNA D1/D2 區(qū)序列擴增電泳圖Fig.3 Electrophoresis pattern of 26S rDNA D1/D2 sequence amplification of PY01 strain

由表7可知,該模型的F值為72.96,P＜0.000 1,說明該模型是極顯著的,且失擬項P＝0.106 8＞0.05,不顯著,表明該模型對因素水平進行了很好的擬合,試驗誤差小。一次項X1與X3對酒精度的影響極顯著(P＜0.01),X2對酒精度的影響顯著(P＜0.05),根據(jù)F值可知各因素對酒精度的影響依次為：酵母接種量(X3)＞初始pH 值(X1)＞主發(fā)酵溫度(X2)。二次項只有X1X3對酒精度的影響顯著。

通過模型得到理論最優(yōu)發(fā)酵條件為：初始pH 值3.91,主發(fā)酵溫度25.82℃,酵母接種量6.23%,預測發(fā)酵后的酒精度為12.57% vol。為驗證該模型的準確性,按照修正后的操作條件：初始pH 值3.9,主發(fā)酵溫度26℃,酵母接種量6.2%,平行進行3 次驗證試驗,得到水蜜桃酒酒精度為12.51% vol,與最優(yōu)條件下預測值基本接近,表明該模型模擬水蜜桃酒的發(fā)酵工藝準確可靠,具有實用價值。

2.8 水蜜桃成品酒指標測定

酒精度、總糖、總酸、干浸出物、菌落總數(shù)、大腸菌群均屬于NY/T 1508-2017[25]中的檢測指標項目。由表8可知,水蜜桃成品酒總糖含量為6.71 g·L-1,根據(jù)標準規(guī)定[25],半干型果酒的總糖(以葡萄糖計)含量為4.1～12.0 g·L-1,表明本研究釀造的水蜜桃酒為半干型果酒。酒精度、總酸含量、干浸出物含量、菌落總數(shù)、大腸菌群數(shù)均符合2017 版果酒行業(yè)標準[25]。成品酒酒體顏色金黃,澄清透明,桃香濃郁,酸甜適中,口感醇厚,具有桃酒應(yīng)有的特征與風味,感官評分為95.0。

表7 回歸模型方差分析Table 7 Regression model analysis of variance

圖4 初始pH 值(A)、主發(fā)酵溫度(B)、酵母接種量(C)對水蜜桃酒發(fā)酵的影響Fig.4 Effect of initial pH value(A)， main fermentation temperature(B)and yeast inoculum(C)on the fermentation of peach wine

表8 成品酒部分指標檢測結(jié)果Table 8 Test results of some indicators of finished wine

3 討論

本試驗從水蜜桃自然發(fā)酵醪中分離篩選出適用于發(fā)酵水蜜桃酒的專用酵母菌株P(guān)Y01,其耐受12%vol的酒精度,可在5 d 內(nèi)使發(fā)酵液酒精度快速升至12%vol 以上,釀造的水蜜桃酒口感香甜、風味純正。比較發(fā)現(xiàn),酵母菌發(fā)酵能力的優(yōu)劣與其對酒精的耐受能力相關(guān),目標菌株P(guān)Y01 發(fā)酵能力較強,其對高濃度酒精的強耐受性可顯著提高酒精產(chǎn)量,是發(fā)酵工業(yè)特別是酒類生產(chǎn)中的重要特性[21]。同時,PY01 菌株釀造水蜜桃酒主發(fā)酵周期短于蔣錫龍等[13]和李澤霞等[9]的研究結(jié)果,其發(fā)酵速度快的特點在果酒的實際生產(chǎn)中可提高設(shè)備利用率,節(jié)約生產(chǎn)成本[39]。PY01 菌株釀造的水蜜桃酒風味純正可能是因為該菌株篩選于水蜜桃自然發(fā)酵醪,存在于原材料中的酵母菌經(jīng)過長期選擇,已經(jīng)適應(yīng)了桃的品質(zhì)與特征,通過一系列生物代謝過程可產(chǎn)生新的營養(yǎng)物質(zhì)與風味成分。

本試驗通過分子生物學技術(shù)對PY01 菌株進行鑒定,其26S rDNA D1/D2 區(qū)序列長度為593 bp,通過BLAST 比對,鑒定結(jié)果為酵母屬釀酒酵母菌。這與張春芝等[18]從不同菌落類型中篩選出具有代表性的6株釀酒酵母,其26S rDNA D1/D2 PCR 擴增引物大小均為500～700 bp 的研究結(jié)果較一致。酵母菌鑒定比較復雜,采用傳統(tǒng)方法分類相當困難,通過分子手段鑒定準確性很高[17]。

在目標菌株P(guān)Y01 的篩選中,可靠靈敏的篩選系統(tǒng)是關(guān)鍵。本試驗首先根據(jù)各菌株細胞與菌落特征進行分離篩選；其次,采用TTC 法與杜氏小管法檢驗菌株的發(fā)酵性能,受氫體TTC 被醇脫氫酶還原后呈紅色,反映酵母菌產(chǎn)酒精能力的大小[19],用于釀酒用途的酵母菌至少要在48 h 內(nèi)發(fā)酵產(chǎn)氣,反映起酵速度[21]；再用含不同酒精度的培養(yǎng)基篩選出耐酒精能力強的菌株；隨后在實際釀造中對比不同菌株的發(fā)酵能力；最后利用GC-MS 分析發(fā)酵液風味,進行感官評定,由此系統(tǒng)獲得的目標菌株P(guān)Y01 具備果酒釀造的基本要求,能快速釀造香氣濃郁、典型性好的水蜜桃酒。但本研究未對分離篩選出的PY01 菌株利用誘變等手段進行改育,因此對利用該菌種發(fā)酵提高水蜜桃酒品質(zhì)特征以及功能性成分尚有待進一步研究。

4 結(jié)論

本研究獲得1 株專用酵母菌PY01(SaccharomycescerevisiaePY01)可適用于快速釀造水蜜桃酒。通過響應(yīng)面法優(yōu)化,采用PY01 釀酒酵母發(fā)酵水蜜桃酒最佳發(fā)酵工藝為：接種量6.2%、初始糖度22°Brix,初始pH值3.9,主發(fā)酵溫度26℃,發(fā)酵時間5 d。在此條件下釀造出的水蜜桃酒顏色金黃透明、桃香濃郁、口感醇厚,各項理化指標均符合NY/T 1508-2017 綠色果酒行業(yè)新標準。本研究結(jié)果為水蜜桃酒產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了優(yōu)質(zhì)的專用酵母菌與一定的工藝基礎(chǔ)。