靈芝栽培病原真菌的鑒定及異硫氰酸烯丙酯對其抑制效果的研究

李月月 張志偉 周化斌 楊海龍

(溫州大學生命與環(huán)境科學學院,浙江 溫州 325035)

靈芝(Ganoderma lucidum)為我國傳統(tǒng)名貴中藥,富含多糖、三萜、氨基酸、微量元素等活性成分,現(xiàn)代藥理學研究表明靈芝具有提高免疫、抗氧化、抗腫瘤、保肝護肝等生物活性[1-3]。隨著人們健康意識的增強,對靈芝的需求也不斷增加,但野生靈芝資源稀少,目前靈芝主要通過人工種植獲得,包括段木栽培和代料栽培,其中段木栽培在靈芝外觀品質(zhì)、活性成分含量、生物轉(zhuǎn)化率等方面均具有較大的優(yōu)勢[4-6],其基本過程為：將榆、楊等闊葉樹木截成一定長度的段木,滅菌后接上菌種進行純種培養(yǎng),菌絲長透段木后埋入土中,通過調(diào)控溫濕度、光照長出靈芝子實體。栽培過程中菌木與土壤直接接觸,如果土壤雜菌多或栽培溫濕度不當很容易長出雜菌,爭奪靈芝基質(zhì)養(yǎng)分,嚴重影響靈芝的產(chǎn)量和質(zhì)量[7]。研究靈芝種植過程中的病原菌有助于指導病害的防治,促進靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

一般來說,病原菌分離純化后采用形態(tài)學、生理生化等方法進行鑒定,這些傳統(tǒng)的鑒定方法效率低、容易受到環(huán)境因素的干擾,而基于分子生物學技術的rDNA-ITS 序列分析用于真菌鑒定更客觀、省時、簡便、快速。早在2000年,Suga 等[8]分析了植物病原真菌的核糖體DNA 基因的內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的核苷酸序列(rDNA-ITS),構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹,確定了病原菌Fusarium solani；蘭玉菲等[9]分離了香菇病害菌,通過對rDNA-ITS 序列分析,從分子水平上確定病原菌為米根霉(Rhizopus oryzae)；郜海燕等[10]對采后藍莓病原菌進行研究,采用rDNA-ITS 技術分別確定藍莓主要病原菌為灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)、木霉(Trichoderma viridescens)和青霉(Penicilliumsp.)。目前,rDNA-ITS 測序方法是國內(nèi)外鑒定病原真菌的重要手段。本研究從浙江省龍泉市靈芝種植基地采集靈芝栽培過程中霉變的段木及靈芝子實體,分離純化得到病原真菌菌株,采用形態(tài)學結(jié)合rDNA-ITS 測序方法對菌株進行鑒定,研究分離菌株的生物特性,并分析植物精油組分異硫氰酸烯丙酯對所分離菌株的抑制作用,以期為靈芝段木栽培或采后真菌病害的防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

病變靈芝栽培段木和靈芝子實體(圖1),分別于2018年5月和8月采自浙江省龍泉市靈芝種植基地。

圖1 霉變靈芝栽培段木和靈芝子實體Fig.1 G.lucidum cultivating wood and fruiting body infected by pathogenic fungi

1.2 培養(yǎng)基與異硫氰酸烯丙酯

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g,自然pH 值。察氏培養(yǎng)基：蔗糖30 g、NaNO32 g、K2HPO41 g、MgSO40.5 g、KCl 0.5 g、FeSO40.1 g、瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL,pH 值7.0～7.2。PCA 培養(yǎng)基：胰蛋白胨5.0 g、酵母浸膏2.5 g、葡萄糖1.0 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL,pH 值7.0～7.2。WA 培養(yǎng)基：瓊脂20 g、蒸餾水1 000 mL。豆芽-蔗糖培養(yǎng)基：豆芽200 g、蔗糖15 g、瓊脂15 g、蒸餾水1 000 mL。

異硫氰酸烯丙酯,購自美國Sigma 公司。

1.3 主要儀器與設備

SevenEasy pH 計,梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司；VS-840K-U 潔凈工作臺,蘇州安泰空氣技術有限公司；BT124S 電子天平,北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；LRH-250A 生化培養(yǎng)箱,廣東醫(yī)療器械廠；T100 PCR 儀,美國Bio-Rad 公司；5424R 冷凍離心機,德國Eppendorf 公司；BA2100 數(shù)碼顯微鏡,廈門麥克奧迪實業(yè)集團有限公司。

1.4 試驗方法

1.4.1 病原真菌的分離純化 將采集后的病原菌在無菌操作臺上接種于含有抗生素的PDA 培養(yǎng)基中,置于28℃黑暗培養(yǎng),待菌絲萌發(fā)后,進行4 次純化獲得其純化培養(yǎng)物,接種于斜面PDA 培養(yǎng)基并于4℃保藏備用。

1.4.2 病原真菌形態(tài)學分析 將保藏菌株接種到PDA 平板上活化,參考載玻片溫室培養(yǎng)法挑取菌株孢子放置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)3～4 d。利用顯微成像系統(tǒng)觀察孢子形態(tài)和大小、菌絲特征及分支情況等,并拍照。病原真菌形態(tài)學鑒定參照《真菌鑒定手冊》[11]。

1.4.3 病原真菌分子生物學鑒定 ITS 序列分析參照楊成龍等[12]的方法。收集菌絲,采用Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒(SK8259)提取病原菌DNA。采用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)、ITS4(5′-TCC TCCGCTTATTGATATGC-3′)對病原菌的基因組DNA 進行PCR 擴增。25 μL PCR 反應體系包括10×PCR buffer 2.5 μL、d NTP(2.5 mmol·L-1)1 μL、模板DNA(20～50 mg·μL-1)0.5 μL、5 U·μL-1TaqDNA 聚合酶0.2 μL、ITS1 和ITS4 引物(10 mmol·L-1)各0.5 μL、ddH2O 加至20 μL。PCR 反應程序：94℃預變性4 min；94℃變性45 s,55℃退火45 s,72℃延伸1 min,共30 個循環(huán),最后72℃修復延伸10 min,4℃終止反應。

擴增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,在凝膠成像儀上觀察并拍照,送至上海生工生物公司測序,將所得序列與GenBank 中已知序列進行BLAST 比對和同源性分析,選取與病原菌ITS 序列同源性高和形態(tài)相近的菌株序列,用MEGA 7.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹[13-14]。

1.4.4 病原菌生物學特性分析 將純化保存的病原菌活化后接種至PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3～4 d,采用十字交叉法測量菌落直徑,在其他條件固定的條件下,依次分析不同培養(yǎng)基、溫度、碳源、氮源、pH 值對菌絲生長的影響。

培養(yǎng)溫度：病原菌接種到PDA 培養(yǎng)基后,分別置于6、20、25、28、30℃條件下恒溫培養(yǎng)。

pH 值：分別以0.2% NaOH 或0.2%HCl 溶液調(diào)節(jié)PDA 培養(yǎng)基pH 值至4、5、6、7、8、9、10、11,接種病原真菌,28℃恒溫培養(yǎng)。

碳、氮源：以察氏培養(yǎng)基為基礎培養(yǎng)基,用等質(zhì)量的葡萄糖、果糖、木糖、可溶性淀粉、麥芽糖、乳糖代替蔗糖作為碳源；用等質(zhì)量的牛肉膏、蛋白胨、尿素、酵母膏代替NaNO3作為氮源；28℃恒溫培養(yǎng)。

1.4.5 異硫氰酸烯丙酯對病原菌的抑制試驗 分別將病原菌接種于PDA 培養(yǎng)基,28℃培養(yǎng)至菌落直徑達培養(yǎng)基的1/4～1/3,然后分別按0(加入生理鹽水)、10、20 μL·L-1的劑量加入異硫氰酸烯丙酯,繼續(xù)培養(yǎng)72～96 h,測量加入異硫氰酸烯丙酯培養(yǎng)前后的菌落直徑。按照公式計算抑菌率(Ⅰ)：

式中,E0和E1分別為試驗組加入異硫氰酸烯丙酯(10、20 μL·L-1)培養(yǎng)前后的菌落直徑,mm；C0和C1分別為對照組加入生理鹽水培養(yǎng)前后的菌落直徑,mm。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原真菌的形態(tài)學特征

從霉變靈芝段木和子實體上經(jīng)純化得到4 株分離菌株,分別編號為OTA、OTB、OTC 和OTD(圖2)。菌株OTA 生長很快,氣生菌絲體絨狀,菌絲白色,隨著菌絲增長顏色加深變成黃綠色,進而黃綠色菌絲延伸直至長滿平板,老熟時表面生出白色顆粒狀芽孢,背面呈紅橙色,顯微鏡下觀察呈樹根狀,疏散,分生孢子呈卵形、橢圓形或近球形,整體光滑,3.2 μm×3.8 μm。菌株OTB 生長較快,菌落平坦,灰色呈粉粒狀,中間有灰白點相間分布,有白色的邊緣,最后變灰色；基質(zhì)由白色轉(zhuǎn)為淺灰色,并隨著培養(yǎng)時間的延長逐步加深,整體較厚,顯微鏡下觀察呈掃帚狀,分生孢子呈球形,普遍片狀分布,孢梗莖結(jié)實。菌株OTC 在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)4～6 d 可長滿,先長出白色絨狀菌絲,很快向周圍蔓延到壁,呈環(huán)狀由四周向中間變?yōu)榫G色,同時伴隨菌絲變厚,菌落呈現(xiàn)粉末狀,整個菌落較為平坦,成熟后期有黃褐色線狀斑痕,分生孢子梗生于菌絲,一端分生孢子梗較細,頂端呈帚狀分枝,分子孢子大多呈圓形,多為雙輪生。菌株OTD 生長較緩慢且易被感染,點狀擴散,黑色邊緣處有白色菌絲,培養(yǎng)7 d 可長到2/3,長滿后的菌落致密結(jié)實,有小的球狀隆起,且易在表面聚集小水珠,接觸即可浸濕菌落表面,背面有褶皺,分生孢子梗數(shù)根叢生,具隔膜,稍彎曲,頂端有分枝,較為膨脹,分生孢子聚生于小梗上,呈卵圓形或橢圓形,單胞,(4.5～6.5)μm×(1.5～2.5)μm,無色至淡色。依據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)學特征,參考《真菌鑒定手冊》[11],初步鑒定分離菌株OTC 為木霉屬(Trichodermasp.),分離菌株OTB、OTD 均為青霉屬(Penicilliumsp.),分離菌株 OTA 為曲霉屬(Aspergillus)。

圖2 病原真菌菌株的形態(tài)特征觀察Fig.2 Observation on morphological characters of fungal pathogen strains

2.2 rDNA-ITS 序列分析

以真菌rDNA-ITS 區(qū)通用引物ITS1 和ITS4,擴增這4 種病原菌菌株的核糖體DNA,并進行測序,將序列提交GenBank 數(shù)據(jù)庫保存,菌株OTA、OTB、OTC 和OTB 序列的接受號分別為MK027215、MK027214、MK027213 和MK027242。將測序結(jié)果與GenBank 中的基因序列進行比對,再用MEGA7.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3)。菌株OTA 與GenBank 中登記的登錄號為MF681598、MH2794 的黃曲霉聚為一支,相似度達100%,確定為Aspergillus flavus；菌株OTB、OTD 與GenBank 中登記的登錄號為KT887849和KT887856 的頰下青霉聚為一支,相似度為99%,確定為Penicillium infrabuccalum；菌株OTC 為木霉屬菌株Trichodermasp.。

圖3 靈芝段木栽培中主要病原真菌分離株rDNA-ITS 序列系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of fungal pathogens isolated from G.lucidum cultivating wood and fruiting body based on the rDNA-ITS sequences

2.3 病原真菌生物學特性

由圖4-A可知,不同培養(yǎng)基對4 種病原菌菌落生長影響有差異,病原菌整體在PDA 培養(yǎng)基中生長最好,其次是豆芽-蔗糖培養(yǎng)基,大體來看,菌株OTA 和OTC 整體生長較好,菌株OTD 最差。由圖4-B可知,培養(yǎng)3 d 后,4 種病原菌菌絲在6～30℃均可生長,且菌落生長直徑在此溫度梯度范圍內(nèi)呈現(xiàn)上升到一定值后趨于穩(wěn)定或先上升后下降的趨勢,菌株OTA 適宜生長溫度為25～30℃。菌株OTB 相比其他病原菌有較寬的適宜生長溫度,在20～30℃均顯現(xiàn)出較好的菌絲生長狀況；菌株OTC 喜好較高的溫度,在28～30℃生長最佳；菌株OTD 最適生長溫度為28℃。菌株OTA 和OTB 分別在以木糖和葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長較好,菌株OTC 和OTD 分別在以果糖和蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長得較好(圖4-C)；菌株OTA和OTB 的最適氮源分別為牛肉膏和尿素,菌株OTC和OTD 的最適氮源分別為NaNO3和蛋白胨(圖4-D)。由圖4-E可知,4 種病原菌在pH 值為4～11 時均能生長,但pH 值對不同菌株菌絲生長的影響有差異,菌株OTA 受pH 值影響較??；菌株OTB 在酸性環(huán)境中的生長狀況優(yōu)于堿性環(huán)境,在pH 值5～7 生長最佳；與OTB 類似,菌株OTC 和OTD 在酸性環(huán)境中生長較好,其中OTC 適宜在弱酸性條件(pH 值6～7)生長,OTD 適宜生長pH 值較低,為4～5。

2.4 異硫氰酸烯丙酯對病原真菌的抑制作用

精油組分異硫氰酸烯丙酯對所分離的靈芝病原菌株具有較好的抑制效果,當異硫氰酸烯丙酯濃度為10 μL·L-1時,對菌株OTB 的抑制率為85%,對菌株OTA的抑制率達96.2%；當異硫氰酸烯丙酯濃度為20 μL·L-1時,各菌株的菌絲生長基本停止,對菌株OTA的抑菌率達99.1%,對其他3 株病原菌的抑制率也超過97%(圖5)。

3 討論

圖4 不同培養(yǎng)基、碳源、氮源、溫度和pH 值對病原真菌菌絲生長的影響Fig.4 Effects of different media， carbon sources， nitrogen sources， temperatures and pH values on mycelial growth of four fungal pathogens

病原真菌污染是食用菌栽培過程中需要重點防治的問題之一,一旦染病,輕者影響產(chǎn)量和質(zhì)量,重者絕收。同一種食用菌有可能感染多種病原真菌,而不同食用菌品種所感染的病原菌存在差異,導致黑木耳代料栽培培養(yǎng)基軟化病的病原菌為黃孢原毛平革菌(Phanero chaetechrysosporium)[15],而木耳“白毛菌病”的病原真菌為尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)和厚垣鐮孢(F.chlamydosporum)[16],Zhang 等[17]確 定F.equiseti和F.sporotrichioides也是木耳的病原真菌；影響香菇菌棒出菇的病害菌為米根霉(R.oryzae)[9]；病原真菌康寧木霉(Trichoderma koningiopsisDC3)、擬莖點霉(Phomopsissp.MP4)、環(huán)狀毛霉(Mucor circinelloidesMP5)和布魯氏枝孢菌(CladosporiumbruhneiMP6)會導致杏鮑菇減產(chǎn)、腐爛[18]；形態(tài)學與分子生物學分析表明,截頭炭團菌(Annulohypoxylon annulatum)是銀耳段木栽培的主要雜菌[19]；靈芝栽培過程中的病原菌有綠色木霉(T.uiride)、鏈孢霉(Neurospora sitophila)、匍枝根霉(Rhizopus nigrican)、黑發(fā)菌(Comatricha nigra)、樹狀輪指孢霉(Dactylium dendroides)等[7]。本研究從浙江龍泉靈芝種植基地雜菌污染的靈芝栽培段木、子實體中分離得到4 種菌株,分別為OTA、OTB、OTC、OTD；通過對病原菌的ITS 序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫中的序列進行BLAST 比對,并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合病原菌形態(tài)特征,分別確定OTA 為黃曲霉(A.flavus)、OTB 和OTD為頰下青霉(P.infrabuccalum)、OTC 為木霉屬(Trichodermasp.)。其中對靈芝栽培過程中的黃曲霉(A.flavus)和頰下青霉(P.infrabuccalum)等病害菌進行分離純化、分子生物學鑒定尚屬首次。

圖5 異硫氰酸烯丙酯對4 種病原真菌的抑制作用Fig.5 Inhibition effect of allyl isothiocyanate on the mycelial growth of four fungal pathogens

食藥用真菌病害的發(fā)生與栽培環(huán)境的濕度、溫度和培養(yǎng)基料密切相關,各病原菌的生物學特性由于寄主、地區(qū)等條件不同而存在差異。黃曲霉是我國南方常見的真菌,菌絲有隔,菌落初始略帶黃色,隨后變?yōu)楹志G色,為玉米穗腐病、百合鱗莖腐爛病等農(nóng)作物生產(chǎn)的致腐菌[20],一旦感染便快速蔓延,并可能代謝產(chǎn)生致癌物——黃曲霉毒素[21]。鞏慧玲等[20]報道的黃曲霉適宜生長溫度為25℃、pH 值5～9 條件下均可生長,葡萄糖和蛋白胨為菌絲生長及產(chǎn)孢的最適碳源和氮源。本研究結(jié)果表明,菌株OTA(A.flavus)適宜溫度為25～30℃,最適碳氮源分別為木糖和牛肉膏,與前人研究結(jié)果類似,pH 值對OTA 的生長影響較小。青霉常見于腐爛的農(nóng)作物、水果、蔬菜,多呈灰綠色,青霉病原菌可產(chǎn)細胞壁降解酶,從而能以食用菌、板栗等為營養(yǎng)進行生長[22]。本研究分離獲得的菌株OTB 和OTD均為頰下青霉(P.infrabuccalum),最適碳源分別為葡萄糖和蔗糖,最適氮源分別為尿素和蛋白胨,酸性條件有利于菌株的生長。木霉菌叢密集,分生孢子梗從菌絲側(cè)枝生出,直立,分枝,小枝常對生,分生孢子球形,淡色或無色,廣泛分布于自然界,在腐木、種籽、植物殘體、有機肥、土壤和空氣中尤多,是食用菌生產(chǎn)中危害普遍和嚴重的一類病原菌,主要有綠色木霉(T.viride)、矩孢木霉(T.oblongisporum)、哈茨木霉(T.harzianum)等[23-24]。本研究分離的木霉菌株OTC 的最適碳氮源分別為果糖和NaNO3,最適pH 值為6～7。研究表明,木霉是廣泛應用的生物防治微生物,對防治作物白絹病、立枯病、猝倒病、枯萎病、疫病等有良好的效果[25]。本研究中的木霉菌株OTC 與其他3 種病原菌共同培養(yǎng)時未見被感染現(xiàn)象,但是否有拮抗作用,還有待進一步深入研究。

植物精油是一種天然防霉劑,抑制霉菌生長效果好,且無毒、環(huán)境友好[21]。異硫氰酸烯丙酯為芥末(Brassica juncea)精油的主要成分[26],對黃曲霉(A.flavus)、擴展青霉(P.expansum)、鏈格孢霉(Alternaria alternate)、灰葡萄孢霉(Botrytis cinerea)等真菌的生長具有良好的抑制作用[27-29]。本研究結(jié)果表明,異硫氰酸烯丙酯對靈芝栽培病原菌黃曲霉、頰下青霉和木霉的菌絲生長抑制效果明顯,當異硫氰酸烯丙酯濃度為20 μL·L-1時,各菌株的菌絲生長基本停止。

4 結(jié)論

本試驗初步研究了浙江南部靈芝栽培過程中侵染段木及子實體的病原真菌,分離獲得了4 株病原真菌,其中OTA 為黃曲霉(A.flavus),OTB 和OTD 為頰下青霉菌(P.infrabuccalum),OTC 為木霉菌(Trichodermasp.),并確定青霉、木霉和黃曲霉是靈芝栽培過程中重要的病原真菌。此外,病原真菌菌株的適宜生長溫度、pH 值與靈芝菌相似。抑菌試驗結(jié)果表明,異硫氰酸烯丙酯對黃曲霉、頰下青霉和木霉的菌絲生長抑制效果明顯,可作為安全的防霉劑用于靈芝栽培病原真菌的防治,但其抑菌機理及應用條件需進一步研究。