大豆玉米間作體系溶磷菌篩選及影響因素研究

王 浩，朱思沅，劉曉峰

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030）

磷是植物生長(zhǎng)發(fā)育必需的三大營(yíng)養(yǎng)元素之一[1]，是植物體內(nèi)有機(jī)化合物重要組成，可提高植株抗逆性，在果實(shí)發(fā)育中具有重要作用[2]。我國(guó)土壤中含豐富磷素，但95%磷因與土壤中Fe3+、Ca2+、Al3+結(jié)合形成化合物而喪失有效性，導(dǎo)致施入磷肥當(dāng)季利用率僅5%～25%[3]。為滿足植物所需營(yíng)養(yǎng)元素，往往長(zhǎng)期施用過(guò)量化肥，由此造成土壤板結(jié)，且過(guò)量磷肥經(jīng)雨水沖刷進(jìn)入河流后引發(fā)水體富營(yíng)養(yǎng)化等問(wèn)題[4]。

“植物內(nèi)生菌”是可在植物細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞之間定植的微生物，且可與宿主植物建立穩(wěn)定聯(lián)系[5]。溶磷菌可將土壤中難溶磷通過(guò)一系列生理生化反應(yīng)變成植物可利用磷。大多數(shù)植物內(nèi)生菌具有促進(jìn)宿主植物生長(zhǎng)能力，并可溶解無(wú)機(jī)磷。黃靜等從油菜和玉米中篩選得到多株具溶磷作用的植物內(nèi)生促生細(xì)菌[6]。鄭燕玲選用溶磷圈法從石斛蘭中篩選出解磷菌，發(fā)現(xiàn)其中有兩株真菌和10株細(xì)菌具有解磷能力[7]。

間作即為同一塊土地上種植兩種或多種作物[8]，可利用有限土地資源獲得更大產(chǎn)量。豆科與禾本科作物間作，由于種間促進(jìn)及生態(tài)位互補(bǔ)作用，是一種理想間作模式。禾本科作物需氮量較大，可為豆科作物提供較低的氮素土壤環(huán)境，有利于促進(jìn)豆科作物共生固氮作用，同時(shí)也提高禾本科作物氮素利用效率[9]。其中，大豆與玉米間作是常見間作模式[10]，可提高玉米產(chǎn)量，雖然兩種作物存在競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，但在合適培養(yǎng)環(huán)境下，大豆產(chǎn)量并未降低。本研究擬從間作體系中分離得到內(nèi)生溶磷菌，旨在探究大豆玉米間作體系中內(nèi)生溶磷菌分布情況，進(jìn)而分離對(duì)兩種作物均有適用性的菌株，運(yùn)用此菌種制作菌劑，有望代替部分普通化學(xué)肥料，通過(guò)開發(fā)以溶磷菌為功能菌種的生物緩釋磷肥應(yīng)用于大豆和玉米生產(chǎn)，為減少該體系中化肥施用量探索新途徑。在作物不同組織部位分離內(nèi)生菌，可為生物肥料施用部位提供新思路。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

溶磷菌分離自東北農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)實(shí)習(xí)與示范中心向陽(yáng)基地3行大豆3行玉米間作體系（行距為60 cm），大豆品種為東富1號(hào)，玉米品種為吉農(nóng)大。采樣時(shí)期為大豆初花-玉米苗期，分別隨機(jī)采集大豆及玉米植株各3株，置于冰上保鮮至實(shí)驗(yàn)室，樣品根部經(jīng)流水清洗表面泥土后用紙巾吸干表面水分。取大豆及玉米根、莖、葉組織，經(jīng)95%酒精處理30 s后用次氯酸鈉（3.5%）處理4 min，大量無(wú)菌水反復(fù)沖洗7次。組織樣品經(jīng)表面消毒后，研磨，生理鹽水制成濃度系列梯度至10-6，取10-3、10-4、10-5和10-6等4個(gè)濃度梯度200 μL稀釋液涂平板，每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)。

1.2 培養(yǎng)基

無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基：Glucose 10.0 g；（NH4）2SO40.5 g；MgSO4·7H2O 0.3 g；Ca3（PO4）210 g；NaCl 0.3 g；MnSO4（1%溶液）1 mL；FeSO4（1%溶液）1 mL；Agar 20 g；Deionized H2O 1 000 mL。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g；蛋白胨 10 g； NaCl 5 g； Agar 17.5 g； Deionized H2O 1 000 mL。

無(wú)機(jī)磷固體平板培養(yǎng)基：Glucose 10.0 g；（NH4）2SO40.5 g；MgSO4·7H2O 0.3 g；Ca3（PO4）210 g；NaCl 0.3 g；MnSO4（1%溶液）1 mL；FeSO4（1%溶液）1 mL；Agar 20 g；Deionized H2O 1 000 mL。

1.3 鉬銻抗比色法

所用藥品包含：濃硫酸、鉬酸銨、0.5%酒石酸銻鉀溶液、抗壞血酸、Tris、Na2EDTA·2H2O、純乙酸、NaOH、1 mol·L-1Tris-HCl Buffer（pH 8.0）、0.5 mol·L-1EDTA（pH 8.0）、（NH4）2SO4、MnSO4、MgSO4· 7H2O、Ca3（PO4）2、 FeSO4、 NaCl、牛肉膏、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂、蔗糖、磷標(biāo)準(zhǔn)溶液等。

1.4 溶磷菌平板篩選

根據(jù)常規(guī)細(xì)菌分離法將菌懸液涂布在無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中[11]，待菌落長(zhǎng)出后，挑取培養(yǎng)基上菌落較大、生長(zhǎng)快、具有明顯溶磷圈菌株，劃線法涂布在新無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基中，直至得到純單個(gè)菌落，用牛肉膏蛋白胨試管斜面4℃保存。

1.5 磷標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定

取7支50 mL容量瓶，編號(hào)0～6號(hào)，分別加入0、15、30、45、60、75和90 μL磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，再加入2滴2,4-二硝基苯酚作指示劑，5 mL鉬銻抗顯色，最后去離子水定容至刻度，混勻。使用酶標(biāo)儀（品牌Thermo，型號(hào)Multiskan Sky），在720 nm波長(zhǎng)下，以0號(hào)溶液為對(duì)照，分別測(cè)定各管溶液吸光度值，且每個(gè)管重復(fù)操作3次，校正吸光值為吸光度測(cè)定值減去對(duì)照管測(cè)定值。

1.6 溶磷能力測(cè)定

在OD720=0.8，取菌懸液100 μL加入50 mL無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，搖床150 r·min-1，28℃培養(yǎng)15 d后4 000 r·min-1，28 ℃離心20 min，取上清液，利用鉬藍(lán)比色法在酶標(biāo)儀OD=720 nm處測(cè)定吸光度。

1.7 菌株分子生物學(xué)鑒定

1.7.1 內(nèi)生溶磷菌株培養(yǎng)與基因組DNA提取

將試驗(yàn)對(duì)象菌株培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，取300 μL菌液于1.5 mL離心管，12 000 r·min-1離心2 min，棄上清液，于沉淀中加入提取液300 μL（提取液：25%chelex-100，0.5%NP40，TE配制，pH 8.0～9.0），56℃孵育30 min，100℃水浴10 min，取出后12 000 r·min-1離心2 min，取上清液，即為DNA。取DNA樣品1 μL，瓊脂糖電泳檢測(cè)合格后用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.7.2 目標(biāo)16S rDNA產(chǎn)物擴(kuò)增和序列分析

本試驗(yàn)采用PCR引物27F（5'AGAGTTTGATC CTGGCTCAG 3'）和 1492R（5'TACGGHTACCTTGT?TACGACTT 3'）。PCR條件參考蔣國(guó)彪等方法[4]。

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物作電泳檢測(cè)，確定其是否為目標(biāo)片段，將目標(biāo)DNA片段溶液委托蘇州泓迅生物科技有限公司測(cè)序，將序列提交NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，在線比對(duì)，下載相近種屬模式菌株序列，采用Mega 5.0軟件Neighbor-joining算法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.8 不同因素對(duì)內(nèi)生菌溶磷效果的影響

1.8.1 不同碳源對(duì)細(xì)菌溶磷能力的影響

選用5種不同碳源：淀粉、乳糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖，培養(yǎng)基中其他成分及含量不變。分別將上述培養(yǎng)基加入100 mL錐形瓶，裝液量為50 mL。每份培養(yǎng)基中接入1.5 mL菌液，同一處理3個(gè)重復(fù)。置于搖床內(nèi)，150 r·min-128℃條件下，培養(yǎng)96 h后將菌液10 000 r·min-1離心，取其上清液按照鉬銻抗比色法測(cè)定樣品中有效磷增量，取3次重復(fù)平均值。

1.8.2 不同氮源對(duì)細(xì)菌溶磷能力的影響

選用5種不同氮源：硝酸鈉、氯化銨、碳酸氫銨、尿素、硫酸銨，培養(yǎng)基中其他成分及含量不變。分別將上述培養(yǎng)基加入到100 mL錐形瓶，裝液量為50 mL。每份培養(yǎng)基中接入1.5 mL菌液，同一處理3個(gè)重復(fù)。置于搖床內(nèi)，150 r·min-128℃條件下，培養(yǎng)96 h后將菌液10 000 r·min-1離心，取其上清液按照鉬銻抗比色法測(cè)定樣品中有效磷增量，取3次重復(fù)平均值。

1.8.3 pH對(duì)細(xì)菌溶磷能力的影響

改變液體培養(yǎng)基pH，設(shè)定5個(gè)不同值：5、6、7、8、9，且不改變培養(yǎng)基中其他成分及含量。將不同pH培養(yǎng)基分別添加到100 mL錐形瓶，裝液量為50 mL，每份培養(yǎng)基中接入1.5 mL菌液，同一處理3個(gè)重復(fù)。置于搖床內(nèi)，150 r·min-128℃條件下，培養(yǎng)96 h后將菌液10 000 r·min-1離心。鉬銻抗比色法測(cè)定上清液樣品中有效磷增量，取3次重復(fù)平均值。

1.8.4 溫度對(duì)細(xì)菌溶磷能力的影響

在100 mL錐形瓶中，裝入50 mL液體培養(yǎng)基，再接入1.5 mL菌液，同一處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。設(shè)置5種不同搖床溫度：20、25、30、35和40℃，150 r·min-1搖床，培養(yǎng)96 h后將菌液10 000 r·min-1離心。鉬銻抗比色法測(cè)定上清液樣品中有效磷增量，取3次重復(fù)平均值。

1.8.5 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)菌溶磷能力的影響

在100 mL錐形瓶中，裝入50 mL液體培養(yǎng)基，再接入1.5 mL菌液，同一處理設(shè)置3個(gè)重復(fù)。置于搖床內(nèi)，選擇5個(gè)不同培養(yǎng)時(shí)間（48、96、144、192和240 h）培養(yǎng)，完成后將菌液10 000 r·min-1離心。鉬銻抗比色法測(cè)定上清液樣品中有效磷增加量，取3次重復(fù)平均值。

1.8.6 磷酸鹽濃度對(duì)細(xì)菌溶磷能力的影響

將培養(yǎng)基中磷酸鈣含量分別設(shè)為：4～8 g·L-1，濃度間隔為1 g·L-1。培養(yǎng)基中其他成分及含量不變。分別將不同磷酸鈣含量培養(yǎng)基加入100 mL錐形瓶，裝液量為50 mL，每份培養(yǎng)基中接入1.5 mL菌液，同一處理3個(gè)重復(fù)。然后將其置于搖床內(nèi)，選擇150 r·min-1和28℃條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)96 h后將菌液10 000 r·min-1離心。取其上清液按照鉬銻抗比色法測(cè)定樣品中有效磷增量，取3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌篩選

大豆根、莖、葉中分離的內(nèi)生菌株溶磷圈不明顯。玉米根、莖、葉中分離到35株具有溶磷效果的菌株。

2.2 各菌株對(duì)難溶性磷酸鹽溶解能力測(cè)定結(jié)果

將初步篩選得到的35株菌株分別接入無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基中，28℃150 r·min-1搖床培養(yǎng)15 d后測(cè)定其有效磷含量，測(cè)得Y-18溶磷效果最強(qiáng)，為447.59 mg·L-1°

2.3 菌株Y-18鑒定

2.3.1 部分生理生化性狀

鑒定Y-18菌株生理生化性狀分析及遺傳學(xué)，其部分生理生化性狀見表1。

表1 Y-18生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain Y-18

2.3.2 遺傳學(xué)鑒定

Y-18測(cè)序比對(duì)結(jié)果為羅旺醋桿菌（Acetobacter lovaniensis），構(gòu)建Acetobacter屬內(nèi)系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖1。

圖1 采用臨近法構(gòu)建Y-18與相近參比菌株16S rRNA基因系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 Neighbour-joining tree showing the phylogenetic relationships of strain Y-18 and phylogenetically related reference strains based upon the 16S rRNA gene

2.4 不同因素對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

2.4.1 不同碳源對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

由圖2可知，當(dāng)碳源為葡萄糖時(shí)，菌株Y-18具有最大溶磷能力，達(dá)411.40 mg·L-1，與其他碳源相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，初步表明碳源變化對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響尤為顯著。

圖2 不同碳源對(duì)Y-18溶磷能力的影響Fig.2 Effects of different carbon sources on the phosphorous solubility of Y-18

2.4.2 不同氮源對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

結(jié)果見圖3。

由圖3可知，當(dāng)?shù)礊榱蛩徜@時(shí)，菌株Y-18具有最大溶磷能力，達(dá)521.60 mg·L-1，且與其他氮源相比具有明顯優(yōu)勢(shì)，初步表明氮源變化對(duì)菌株Y-18溶磷能力影響較為顯著。

圖3 不同氮源對(duì)Y-18溶磷能力的影響Fig.3 Effects of different nitrogen sources on the phosphorous soluble capacity of Y-18

2.4.3 不同溫度對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

由圖4可知，培養(yǎng)溫度為25℃時(shí)，菌株Y-18具有最大溶磷能力，達(dá)323.65 mg·L-1。當(dāng)溫度超過(guò)25℃，菌株Y-18溶磷能力明顯下降，30℃后在一定范圍內(nèi)保持穩(wěn)定。由此可初步判斷，25℃條件下菌株Y-18溶磷能力最強(qiáng)。

2.4.4 不同磷酸鹽含量對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

由圖5可知，培養(yǎng)基中難溶性磷酸鹽含量為7g·L-1時(shí)，菌株具有最大溶磷能力，達(dá)378.14mg·L-1，與其他含量相比優(yōu)勢(shì)明顯，初步表明培養(yǎng)基中難溶性磷酸鹽含量變化對(duì)菌株Y-18溶磷能力影響顯著。

2.4.5 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

由圖6可知，培養(yǎng)時(shí)間為3 d時(shí)，菌株Y-18具有最大溶磷能力，達(dá)329.28 mg·L-1，但與5 d相比差異較小，初期隨培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)，菌株Y-18溶磷能力隨之提高，幅度明顯，而培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)3 d后，菌株Y-18溶磷能力提高幅度有限，可初步判斷3 d為菌株Y-18最佳培養(yǎng)時(shí)間，72 h后培養(yǎng)時(shí)間延續(xù)對(duì)于菌株Y-18溶磷能力的影響微弱。

圖4 不同溫度對(duì)Y-18溶磷能力的影響Fig.4 Effects of different temperatures on the phosphorous solubility of Y-18

圖5 不同磷酸鹽含量對(duì)Y-18溶磷能力的影響Fig.5 Effects of different phosphate contents on the phosphorous solubility of Y-18

圖6 不同培養(yǎng)時(shí)間對(duì)Y-18溶磷能力的影響Fig.6 Effect of different culture times on the phosphorous soluble capacity of Y-18

2.4.6 不同pH對(duì)菌株Y-18溶磷能力的影響

由圖7可知，培養(yǎng)基pH為5時(shí)，菌株Y-18具有最大溶磷能力，達(dá)141.23 mg·L-1，隨培養(yǎng)基pH升高，菌株Y-18溶磷能力隨之降低，尤其是pH升至8時(shí)，下降幅度較大。而pH超過(guò)8后，菌株溶磷能力略上升。從圖中可初步判斷，即pH 5為菌株Y-18最佳培養(yǎng)pH，且pH變化對(duì)菌株Y-18溶磷能力影響較顯著。

圖7 不同pH對(duì)Y-18溶磷能力的影響Fig.7 Effects of different pH values on the phosphorous solubility of Y-18

3 討論與結(jié)論

磷元素作為土壤中最難吸收營(yíng)養(yǎng)元素之一[12]，提高磷吸收轉(zhuǎn)化率非常重要，本試驗(yàn)在大豆玉米間作體系中的玉米根、莖、葉中分離得到內(nèi)生溶磷菌35株，并從中溶磷篩選得到1株溶磷效果最佳菌株Y-18，溶磷量可達(dá)447.59 mg·L-1。溶磷菌平均溶磷量8.88～575.3 mg·L-1[13-14]，因此Y-18溶磷量屬于較高水平。此株高效溶磷菌株為羅旺醋桿菌（Acetobacter lovaniensis）。姜曉芝研究表明，醋酸菌最適pH 3.5～6.5，最適溫度30℃[15]。本試驗(yàn)結(jié)果Y-18溶磷效果最適pH 5，最適溫度25℃，與其相符，且與王斌等革蘭氏陰性菌鑒定結(jié)果一致[16]。溶磷菌鑒定結(jié)果為醋酸菌的研究較少，下一步將探究此類菌屬溶磷機(jī)理。

本試驗(yàn)中，通過(guò)固體無(wú)機(jī)磷平板初篩溶磷圈直徑與鉬銻抗比色法測(cè)定的溶磷量具有不完全一致性，溶磷圈最大菌株在鉬銻抗比色法測(cè)定中溶磷量并非最高。趙越等在解磷菌特性研究中指出可通過(guò)固體培養(yǎng)基觀察溶磷圈，該定性分析方法具有一定局限性，液體培養(yǎng)下定量分析更合理[17]。培養(yǎng)時(shí)間超過(guò)3 d時(shí)，Y-18溶磷能力已呈下降趨勢(shì)，即使有一定幅度上升但非峰值，由于培養(yǎng)時(shí)間過(guò)于緊密，且有下降再上升情況，應(yīng)將培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，改善后續(xù)試驗(yàn)。在篩選溶磷菌時(shí)，本試驗(yàn)參考方志軒培養(yǎng)時(shí)間15 d[5]，后期針對(duì)Y-18探究培養(yǎng)時(shí)間單因素時(shí)發(fā)現(xiàn)可適當(dāng)減少培養(yǎng)時(shí)間；由于菌株種屬特點(diǎn)，其溶磷能力在pH 5時(shí)最大，并隨pH增加而減小；在磷酸鈣含量7 g·L-1達(dá)到最大，含量過(guò)小無(wú)法有效激活Y-18溶磷力，過(guò)大時(shí)因磷酸鈣是微溶物使培養(yǎng)基內(nèi)沉淀過(guò)多。本試驗(yàn)在初步篩選高效溶磷菌時(shí)，采用培養(yǎng)條件為：碳源為葡萄糖，氮源為硫酸銨，pH 7，培養(yǎng)溫度為28℃，磷酸鹽含量為7.28 g·L-1，此時(shí)溶磷量達(dá)447.59 mg·L-1。在本試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，優(yōu)化培養(yǎng)條件，可進(jìn)一步提高Y-18菌株溶磷量。

目前從作物根際土壤中分離到具有溶磷能力的內(nèi)生菌大多數(shù)為假單胞菌屬（Pseudomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、草生歐文氏菌（Erwinia herbico?lav）和成團(tuán)泛菌屬（Pantoea agglomerans）等[18]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)具有高效溶磷能力的羅旺醋酸桿菌，在以往研究中報(bào)道較少。醋酸桿菌最適pH偏酸性，東北地區(qū)土地多為弱酸性，如何在實(shí)際應(yīng)用中最大限度發(fā)揮該菌株溶磷效果具有重要意義。