生物藥肥對水稻秧苗免疫抗病機(jī)理的研究

丁 偉，高文逸，程 茁，戴航宇

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030）

水稻是中國重要糧食作物。20世紀(jì)80年代，黑龍江省開始大面積推廣水稻旱育稀植技術(shù)，水稻單產(chǎn)水平不斷提高[1]。目前化學(xué)壯秧劑在水稻育秧過程中大量應(yīng)用，化學(xué)壯秧劑由調(diào)酸劑、無機(jī)肥料和化學(xué)殺菌劑復(fù)配而成，調(diào)酸劑大多為工業(yè)濃硫酸，不僅生產(chǎn)過程具有危險(xiǎn)性，且應(yīng)用過程也對水田生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重污染[2]。生物藥肥是將有益功能微生物與作物所需養(yǎng)分結(jié)合，在生產(chǎn)上可防治有害生物，滿足作物生長發(fā)育養(yǎng)分需求。國內(nèi)外該領(lǐng)域相關(guān)研究處于起步階段，目前國內(nèi)尚無生物藥肥國家或行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。因此，研發(fā)環(huán)境友好的生物藥肥替代化學(xué)壯秧劑成為該領(lǐng)域研究熱點(diǎn)。

農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，利用植物免疫作用減少化學(xué)農(nóng)藥施用量，對解決環(huán)境污染問題具有重要意義。自從《Nature》報(bào)道植物本身存在有效免疫系統(tǒng)后[3]，國內(nèi)外免疫相關(guān)研究迅速發(fā)展，使誘導(dǎo)植物抗病性進(jìn)入實(shí)用化階段。傳統(tǒng)農(nóng)藥僅針對特定病害，忽視植物對病原菌抵抗能力?？衫猛庠粗参锩庖呶镔|(zhì)激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生廣譜抗病、抗逆能力，調(diào)節(jié)植物體內(nèi)代謝系統(tǒng)、促進(jìn)植物生長。外源植物免疫物質(zhì)一般分為兩類：一是植物免疫誘導(dǎo)子，包括：蛋白、寡糖、生物代謝產(chǎn)物或有機(jī)活性小分子；二是植物免疫誘導(dǎo)菌，包括：木霉菌、芽孢桿菌等[4]。植物免疫誘導(dǎo)菌指菌體或其代謝產(chǎn)物可激發(fā)植物免疫系統(tǒng)，使植物獲得抗病及抗逆性能的微生物。利用植物免疫誘導(dǎo)菌生長過程中產(chǎn)生的多種活性物質(zhì)抑制病原菌生長，刺激植株產(chǎn)生抗病因子，誘導(dǎo)植物產(chǎn)生免疫反應(yīng)，可防治多種植物病害[5-6]。

為解決水稻旱育苗過程中立枯病這一難點(diǎn)問題，本文將枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉與礦質(zhì)營養(yǎng)復(fù)配成生物藥肥并用于苗床育秧，測定水稻生長、土壤養(yǎng)分變化及秧苗抗逆酶活性，為利用生物藥肥誘導(dǎo)水稻秧苗免疫抗病替代化學(xué)農(nóng)藥提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株

供試哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、青霉（Penicillium）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院農(nóng)藥學(xué)科保存并提供。

1.1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：葡萄糖12 g，瓊脂10 g，馬鈴薯120 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，充分溶解后121℃滅菌30 min。

NA培養(yǎng)基：蛋白胨6 g，牛肉膏5 g，NaCl 4 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)整pH 7.2，充分溶解后121℃高溫滅菌30 min。

無機(jī)磷真菌液體培養(yǎng)基：NaCl 0.3 g，KCl 0.4 g，(NH4)2SO40.4 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.02 g，MnSO4·H2O 0.02 g，Ca3(PO4)24.0g，葡萄糖10 g，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 7.0，121℃高溫滅菌30 min。

無機(jī)鉀真菌液體培養(yǎng)基：FeCl30.004 g,Na2HPO40.25 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，CaCO30.1 g，鉀長石粉5 g，葡萄糖5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)整pH 7.0，充分溶解后121℃高溫滅菌30 min。

無機(jī)磷細(xì)菌液體培養(yǎng)基：NaCl 0.2 g，CaCO32.3 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，MnSO4·H2O 0.03 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，Ca3(PO4)210 g，葡萄糖3 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)整pH 7.0，充分溶解后于121℃高溫滅菌30 min。

無機(jī)鉀細(xì)菌液體培養(yǎng)基：Na2HPO41.6 g，MgSO4·7H2O 0.4 g，(NH4)2SO40.4 g，鉀長石粉 5 g，（瓊脂20 g），蔗糖5 g，蒸餾水定容至1 000 mL，調(diào)整pH 7.0，充分溶解后121℃高溫滅菌30 min。

1.2 室內(nèi)試驗(yàn)

1.2.1 供試菌株純化培養(yǎng)

取4℃冰箱內(nèi)保存供試菌3株，分別放置于PDA和NA平板中央，倒置培養(yǎng)4～5 d，挑取供試菌株置于PDA和NA平板上進(jìn)一步純化培養(yǎng)。

1.2.2 液體培養(yǎng)條件下解磷和解鉀能力測定

取供試3個菌株培養(yǎng)液10 mL用4層紗布過濾，轉(zhuǎn)移至離心管離心10 min，棄掉上清液加蒸餾水10 mL充分溶解后再次離心，棄掉上清液后將沉淀放入50 mL無菌水中，振蕩20 min使孢子散開。取充分散開孢子懸浮液滴入血球計(jì)數(shù)板后顯微鏡下計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度直到獲得濃度為108cfu·mL-1孢子懸浮液。將制備孢子懸浮液按5%接種量接種于裝有200 mL難溶鉀礦石粉和難溶磷礦石粉液體培養(yǎng)基中，160 r·min-1振蕩培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)0、2、4、6和8 d時(shí)取樣品20 mL，離心后取上清液測定樣品中可溶性鉀和磷含量。

1.3 田間試驗(yàn)

試驗(yàn)于2017～2018年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)園藝實(shí)驗(yàn)站內(nèi)完成，供試水稻品種為龍粳47號。4月10～15日播種，共設(shè)6個處理，見表1。水稻旱育苗小區(qū)面積為8 m2，4次重復(fù)。種子催芽后播種，采用機(jī)插盤旱育秧，育秧盤規(guī)格為：30 cm×60 cm，育秧土過篩后，按設(shè)計(jì)用量分別把供試菌株與N、P、K養(yǎng)分復(fù)配，與過篩育秧土混拌均勻，每盤裝混拌育秧土1.5 kg并澆透底水，每盤播催芽種子50 g，再用育秧土1 kg均勻覆蓋育秧盤表面。

表1 試驗(yàn)處理及生物藥肥中菌液用量Table 1 Test treatment andbacterial fluid dosage in bio-fertilizer

1.3.1 秧苗素質(zhì)測定和立枯病調(diào)查

水稻秧苗4葉期取樣，每處理取100株完整秧苗，清水洗凈根系，吸水紙吸干水分，測定幼苗莖基部寬度、株高、百株秧苗地上和根系鮮重及干重。采用游標(biāo)卡尺測定莖基部寬度，采用烘干法測定干重，先在105℃下殺青30 min，調(diào)整溫度為60℃烘干至恒重。

水稻2葉期后是立枯病發(fā)病高峰期期。在水稻3葉期，調(diào)查試驗(yàn)地立枯病，采用對角線5點(diǎn)取樣法，每點(diǎn)調(diào)查100株，立枯病發(fā)病率計(jì)算公式如下。

1.3.2 苗床土壤抗逆酶活性測定

在水稻2葉和4葉期取樣調(diào)查，取水稻幼苗完全展開葉片，分別測定SOD、POD酶活性，Pro、MDA含量，分別參照比色法[7]，愈創(chuàng)木酚比色法[8]，硫代巴比妥酸比色法和磺基水楊酸法[7]。

1.3.3 土壤養(yǎng)分測定

在播種前、水稻2葉和4葉期取苗床育秧土風(fēng)干并過篩，測定土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀含量，測定方法分別采用堿解擴(kuò)散法[9]、鉬藍(lán)比色法和火焰光度計(jì)法。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)原始數(shù)據(jù)采用Excel 2013軟件整理，應(yīng)用DPS 9.01統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)5%水平差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株解磷和解鉀作用

青霉解磷能力隨時(shí)間延續(xù)而增強(qiáng)，上清液中可溶性磷含量在4 d時(shí)達(dá)最大值，377 μg·mL-1。哈茨木霉在培養(yǎng)6 d時(shí)可溶性磷含量達(dá)峰值，166.10 μg·mL-1，此后上清液中被供試菌株分解釋放的可溶性磷含量降低?？莶菅挎邨U菌具有一定解磷能力，但顯著低于青霉和哈茨木霉。

3個菌株培養(yǎng)基中可溶性鉀含量隨時(shí)間推移均逐漸增加。第10天，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉菌液中可溶性鉀含量達(dá)到最大值，分別為58.43、39.20和38.06 μg·L-1，解鉀能力表現(xiàn)為：枯草芽孢桿菌＞木霉=青霉（見表2）。

表2 菌株解磷和解鉀效果Table 2 Effects of bacterial strain on phosphorus and potassium release

2.2 生物藥肥對水稻苗床土壤養(yǎng)分的影響

測定周期內(nèi)堿解氮和速效鉀含量呈下降規(guī)律，速效磷含量呈先增后降趨勢。水稻2葉和4葉期，木霉+青霉+枯草芽孢桿菌處理堿解氮含量與對照相比提高12.5%，除青霉處理外，均顯著高于其他處理。2葉期，生物藥肥各處理速效磷含量比對照提高39.7%～118.9%。4葉期，速效磷含量開始降低，但木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)配處理速效磷含量仍高于對照53.4%。2葉期，生物藥肥各處理與對照相比速效鉀含量提高15%～40.9%，4葉期，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌處理速效鉀含量最高（見表3）。生物藥肥顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)配的生物藥肥效果最優(yōu)（見表3）。

表3 生物藥肥對水稻苗床土壤養(yǎng)分的影響Table 3 Effects of bio-fertilizer on soil nutrients in rice seedling culture bed

2.3 生物藥肥對水稻秧苗素質(zhì)的影響

生物藥肥顯著增加水稻秧苗莖基部寬度，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)合菌復(fù)配生物藥肥施用后水稻秧苗莖基部寬度最大，較對照增加11.5%。生物藥肥各處理株高與對照間差異不顯著。生物藥肥各處理均顯著增加水稻幼苗地上和根系鮮重和干重，以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)合菌復(fù)配生物藥肥顯著高于單一菌株復(fù)配生物藥肥（見表4）。

2.4 生物藥肥對水稻秧苗抗逆酶的影響

生物藥肥顯著提高SOD和POD活性及Pro含量，降低MDA含量。但施用單一菌株復(fù)配生物藥肥后，在水稻秧苗2葉和4葉期，SOD和POD活性，Pro含量均顯著低于復(fù)合菌株復(fù)配生物藥肥處理，MDA含量則顯著升高。其中木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)合菌復(fù)配生物藥肥處理效果最優(yōu)（見表5）。

2.5 生物藥肥對立枯病發(fā)病率的影響

2017年生物藥肥各處理立枯病發(fā)病率均顯著低于對照，但復(fù)合菌株復(fù)配生物藥肥立枯病發(fā)病率顯著低于單一菌株復(fù)配生物藥肥處理，其中枯草芽孢桿菌+哈茨木霉和木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)合菌株復(fù)配生物藥肥效果最好，無立枯病發(fā)生。2018年立枯病嚴(yán)重，各生物藥肥處理立枯病發(fā)病率均顯著低于對照，復(fù)合菌株復(fù)配生物藥肥立枯病發(fā)病率最低，對立枯病防治效果顯著，其中木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)合菌復(fù)配生物藥肥處理效果最優(yōu)，立枯病發(fā)病率僅為2%（見表6）。

表4 生物藥肥對水稻秧苗素質(zhì)的影響Table 4 Effects of bio-fertilizer on the quality of rice seedlings

表5 生物藥肥對水稻秧苗抗逆酶的影響Table 5 Effects of bio-fertilizer on stress resistance enzyme in rice seedlings

表6 生物藥肥對立枯病的影響Table 6 Effects of bio-fertilizer on the rice seedling blight

3討 論

生物藥肥優(yōu)勢在于集合多種植物免疫誘抗菌并與礦質(zhì)養(yǎng)分復(fù)配，既保證水稻苗期所需營養(yǎng)，又發(fā)揮植物免疫誘抗菌抗病機(jī)制，更大限度發(fā)揮促生作用并提高抗病性，為水稻高產(chǎn)奠定良好基礎(chǔ)。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉產(chǎn)生多種活性物質(zhì)，對多種病原菌具有抑制作用[5-6]?？莶菅挎邨U菌可產(chǎn)生細(xì)菌素、酶類、活性蛋白類和多肽類等物質(zhì)，主要防治對象為絲狀真菌引起的植物病害，如水稻紋枯病（Stagonospo?ra curtisii）、番茄葉霉?。–ladosporium fulvum）、大豆根腐?。‵usarium graminerarum）、棉花立枯病(Rhizoctonia solani）。哈茨木霉在代謝過程中可產(chǎn)生多種抑制病原菌的活性物質(zhì)，如抗菌肽、吡喃酮類抗生素等[10]。青霉菌活性次生代謝產(chǎn)物主要有青霉素類抗生素、生物堿類、蒽醌類和菌素類等[11-12]，均具有抑制病原菌作用?？莶菅挎邨U菌、哈茨木霉和青霉不僅抑制植物病原菌，還釋放誘發(fā)植物局部和系統(tǒng)防御反應(yīng)的化合物，誘導(dǎo)植物增強(qiáng)抗病性?？莶菅挎邨U菌FZB24既產(chǎn)生與植物抗性蛋白合成基因表達(dá)相關(guān)的信號蛋白誘導(dǎo)植物抗性，也分泌相關(guān)蛋白如絲氨酸專性肽鏈內(nèi)切酶直接誘導(dǎo)植物抗性[13]。哈茨木霉產(chǎn)生多種具有誘導(dǎo)作用的活性物質(zhì)，如萜類化合物、酚衍生物、抗毒素、類黃酮、糖苷配基等。接種哈茨木霉和尖孢鐮刀菌的黃瓜植株中CAD、PPO、G-POD、CA-POD和CGA-POD活性顯著提高[14]。青霉菌誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)性抗病性，促進(jìn)植株體內(nèi)病程相關(guān)蛋白基因表達(dá)。青霉滅活菌絲體及其代謝產(chǎn)物誘導(dǎo)煙草POD和PPO活性提高，對煙草黑脛病具有顯著誘導(dǎo)抗病作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，施用枯草芽孢桿菌+哈茨木霉+青霉復(fù)合菌復(fù)配生物藥肥后，誘導(dǎo)水稻秧苗抗逆酶活性顯著高于單一菌株，這是利用復(fù)合菌株復(fù)配生物藥肥降低立枯病發(fā)病率的一個重要原因。

枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉可產(chǎn)生生長調(diào)節(jié)物質(zhì)，促進(jìn)植物幼苗和根系生長發(fā)育，增強(qiáng)植物抗病性，間接減少病害發(fā)生。用枯草芽孢桿菌FZB24(r)處理后黃瓜根系顯著提高，且FZB24(r)液體培養(yǎng)物中還存在植物生長素及類似代謝物如細(xì)胞分裂素、脫落酸、赤霉酸等，對多種植物具有促生作用[14]。研究發(fā)現(xiàn)哈茨木霉發(fā)酵液中存在奈乙酸、吲哚乙酸和赤霉素類活性物質(zhì)，且經(jīng)哈茨木霉發(fā)酵液處理后，顯著提高白菜、菠菜和辣椒鮮重及葉綠素含量，促進(jìn)作物生長發(fā)育。本研究結(jié)果表明，施用生物藥肥后，提高水稻秧苗莖基部寬度、地上部和根系鮮重、干重，水稻秧苗生長健壯，可提高水稻秧苗抗病性。

水稻是以收獲籽粒為目標(biāo)的農(nóng)作物，苗期生長情況直接影響后期生長。水稻苗期僅靠土壤中養(yǎng)分供給無法滿足苗期生長發(fā)育[16]。水稻播種前施足氮、磷、鉀養(yǎng)分，對促進(jìn)根系發(fā)育，保障秧苗正常生長和增強(qiáng)抗病性發(fā)揮作用[17-18]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，枯草芽孢桿菌、哈茨木霉和青霉可通過產(chǎn)生有機(jī)酸、酶類或是莢膜多糖等，溶解土壤中難溶性養(yǎng)分，提高土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀和堿解氮含量[19-20]。本文供試微生物可分解釋放難溶磷和鉀，在施用生物藥肥后，尤其是復(fù)合菌株復(fù)配生物藥肥顯著提高土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量，通過促進(jìn)土壤養(yǎng)分釋放，使水稻秧苗健壯生長，進(jìn)而增強(qiáng)秧苗對立枯病抗病能力。

4結(jié)論

生物藥肥顯著提高土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀含量，明顯增加水稻秧苗莖基部寬度、地上部和根系鮮重、干重，使水稻秧苗SOD、POD活性和Pro含量顯著增加，MDA含量顯著降低，水稻秧苗立枯病發(fā)病率顯著降低，且以木霉+青霉+枯草芽孢桿菌復(fù)合菌復(fù)配的生物藥肥效果最佳。