黑蜂蜂毒的提取及抗腫瘤研究

王林，關(guān)楠楠，李婷婷，王麗麗，李春豐,2*，羅志文,2*

(1.佳木斯大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，黑龍江佳木斯154007;2.佳木斯大學(xué)應(yīng)用昆蟲研究所，黑龍江佳木斯154007)

東北黑蜂是我國(guó)具有獨(dú)特生物特性的地方純系優(yōu)良蜂種，與某些西方蜂種存在很強(qiáng)的配合力，其雜交種類可在我國(guó)北部地區(qū)進(jìn)行大規(guī)模飼養(yǎng)，是良好的蜂種資源，主要產(chǎn)區(qū)地處黑龍江省雙鴨山市饒河縣東北黑蜂國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)內(nèi)[1]。體型較大周身近黑色，繁殖力較強(qiáng)，有極強(qiáng)的抗病和抗逆性[2]。其產(chǎn)物如蜂蜜、蜂王漿給人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，其毒腺也是一個(gè)重要的藥物寶庫(kù)。

蜂毒是由工蜂尾部螫刺腺體中排出的毒汁，蟄刺時(shí)經(jīng)由螯針排出。成分復(fù)雜，藥用價(jià)值極高[3-4]。蜂毒作為一種具有生物活性的天然的生物毒素，內(nèi)含多種生理活性物質(zhì)，例如蜂毒肽、蜂毒明肽、托肽品、肥大細(xì)胞脫粒肽(MCD 肽)、鎮(zhèn)靜肽、安度拉平、心臟肽、透明質(zhì)酸酶、磷脂酶A2、組織胺等。主要具有抗炎、降壓、鎮(zhèn)痛、抗菌、抗輻射、抗腫瘤和抗病毒等作用。筆者通過實(shí)驗(yàn)對(duì)粗蜂毒進(jìn)行提純并利用蜂毒提取物作用于H22小鼠，研究抗腫瘤效果。

1 材料與方法

1.1 材料

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。昆明小鼠，體重20±2 g。正常進(jìn)食、喂水,每日光照。適應(yīng)新環(huán)境后經(jīng)由仔細(xì)觀察挑選，將健康的小鼠取出進(jìn)行分組。腫瘤細(xì)胞株。H22細(xì)胞，由佳木斯大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)儀器：可見分光光度計(jì)；離心機(jī)；電子天平；微量注射器；手術(shù)剪刀；鑷子；游標(biāo)卡尺。實(shí)驗(yàn)藥品：黑蜂蜂毒(購(gòu)自饒河縣黑蜂蜜蜂園)；丙酮；肝素；臺(tái)盼藍(lán)染液；環(huán)磷酰胺(CTX)。

1.2 方法

黑蜂蜂毒的提取：取蜂毒1 g加蒸餾水20 mL后振蕩，使其充分消融。將100 mL丙酮裝入事先準(zhǔn)備好的小廣口瓶中，放入冰箱冷凍室(-18 ℃)內(nèi)約1 h進(jìn)行預(yù)冷。預(yù)冷完畢后取出,向試管內(nèi)注入20 mL，再將已溶解的蜂毒溶液注入試管內(nèi)并用玻棒不斷攪拌，混合液體顯灰白色。隨后將混合液分裝兩個(gè)離心管內(nèi)，再用WS低速離心機(jī)以3000 r/min 的速度離心15 min。離心完畢取出離心管，將上層液體倒掉，離心管底部留有一些淺棕色的沉淀物質(zhì)[5]。再向離心管內(nèi)內(nèi)加入丙酮20 mL，用玻棒將沉淀物搗碎，仍以3000 r/min 繼續(xù)離心15 min，再次倒掉上清液。將管底沉淀物取出，用吹風(fēng)機(jī)快速吹干后再用玻棒將沉淀?yè)v碎，裝入小棕色瓶中備用。

荷瘤小鼠的制備：將接種H22細(xì)胞株的小鼠脫頸處死，放入75%乙醇中處理3 min,在無菌條件下剪開小鼠腹部皮膚，用鑷子夾起腹膜用手術(shù)剪刀開一小口，無菌吸管抽取含H22細(xì)胞的腹水轉(zhuǎn)移至燒杯中。用無菌生理鹽水加肝素溶液將腹水稀釋后，用低速離心機(jī)800 r/min離心5 min，去除上清液得到瘤細(xì)胞，再加入生理鹽水調(diào)整腫瘤細(xì)胞濃度，在顯微鏡下通過滴用0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)(>95%)，通過 PBS 將細(xì)胞數(shù)調(diào)至約為 1.0×10 /mL[6]。(每mL稀釋液中含1.0×10 個(gè)細(xì)胞) 混勻細(xì)胞后,在昆明小鼠右前肢腋下靠外側(cè)皮下注射0.2 mL H22細(xì)胞懸液，創(chuàng)建H22移植瘤小鼠模型。小鼠造模24 h后進(jìn)行隨機(jī)分組，分組完畢即可注射蜂毒。鼠籠內(nèi)定期清理墊料，盡量保證干凈的生活環(huán)境，大約1周后腫瘤體積可達(dá)到 100 mm ，重量1 g左右時(shí)可用于抑瘤實(shí)驗(yàn)。

蜂毒抗腫瘤實(shí)驗(yàn)：待荷瘤小鼠腫瘤體積到達(dá)約100 mm 時(shí)，篩選瘤徑大小相似的小鼠20只，隨機(jī)均分為5組：生理鹽水陰性對(duì)照組、CTX陽(yáng)性對(duì)照組、蜂毒肽高劑量、中劑量和低劑量實(shí)驗(yàn)組[7]。各組均為腹腔注射，各組注射量相等，每天注射1次，持續(xù)10天。每天在固定時(shí)刻點(diǎn)稱量一次小鼠體重，并用游標(biāo)卡尺量取腫瘤體積，腫瘤體積計(jì)算公式：V(體積)= L(長(zhǎng))× W (寬)/2。經(jīng)過10天的給藥、觀察和測(cè)量后，處死5組小鼠，剝離出瘤塊組織稱重，用于評(píng)價(jià)蜂毒對(duì)腫瘤的抑制效果，計(jì)算抑瘤率。

抑瘤率=(陰性對(duì)照組腫瘤的均重-蜂毒組腫瘤的均重)/陰性對(duì)照組腫瘤的均重×100%[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 丙酮提取效果

表1 粗蜂毒與提純后蜂毒比較結(jié)果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，粗蜂毒經(jīng)處置后，pH從4.7升高到5.6，顏色變淺，得率約為81%。

2.2 黑蜂蜂毒抑瘤效果

表2 黑蜂蜂毒對(duì)H22小鼠腫瘤生長(zhǎng)的影響

注：與陰性對(duì)照組比較：p<0.05

表2結(jié)果表明，蜂毒低中高3個(gè)濃度組瘤重都顯著小于陰性對(duì)照組；高劑量組抑瘤率大于低、中劑量組，從表中還可看出蜂膠的抑瘤性與劑量成正比，高劑量組效果最佳，并且有顯著性差異(p<0.05 )，表明東北黑蜂蜂毒能抑制腫瘤的生長(zhǎng)。

3 結(jié)論與討論

粗蜂毒電泳色帶分界不明顯，樣品中應(yīng)該含有糖類物質(zhì)。而經(jīng)過丙酮和凝膠層析處置后，能出現(xiàn)2條清楚的電泳色帶，則說明丙酮能將稠濁的蜂蜜成份清除干凈，凝膠層析可進(jìn)一步純化蜂毒成分。顏色變淺，pH從4.7 上升到5. 5則說明清除了大部分雜質(zhì)和一些有機(jī)酸成分。另外得率可達(dá)81%, 說明提純過程中損失較小，達(dá)到了預(yù)期目的。

蜂毒抗腫瘤的機(jī)制主要有直接殺傷腫瘤細(xì)胞、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡以及調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。通過用東北黑蜂毒素對(duì)H22小鼠腫瘤進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)東北黑蜂蜂毒能抑制腫瘤的生長(zhǎng)，H22小鼠的生命延長(zhǎng)，證明了蜂毒具有直接殺傷小鼠腫瘤細(xì)胞的作用，直接殺傷腫瘤細(xì)胞同時(shí)對(duì)腫瘤也有一定的治療作用。