高效液相色譜法測(cè)定復(fù)合預(yù)混合飼料中的25-羥基維生素D3

張浩然 張亦菲 徐 汀 田 愷 華賢輝 黃家鶯*

（上海市獸藥飼料檢測(cè)所，上海201103）

維生素D3在機(jī)體中有調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)骨骼生長(zhǎng)及鈣化的作用[1]。作為維生素D3在機(jī)體內(nèi)的代謝產(chǎn)物，25- 羥基維生素D3（25-OH-D3）更易被機(jī)體吸收[2]，因此在養(yǎng)殖業(yè)也得到了廣泛應(yīng)用。相應(yīng)地，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第2625 號(hào)公告對(duì)25-OH-D3的使用限量做出規(guī)定，配合飼料中的最高限量：豬50 μg/kg，肉雞、火雞100 μg/kg、其他家禽80 μg/kg，但缺乏相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行質(zhì)量控制。復(fù)合預(yù)混合飼料是配合飼料中25-OH-D3的主要來源之一，若要從源頭控制飼料中25-OH-D3的質(zhì)量，必須建立復(fù)合預(yù)混合飼料中25-OH-D3的測(cè)定方法。本文建立了復(fù)合預(yù)混合飼料中25-OH-D3含量測(cè)定的方法，能夠?qū)ζ滟|(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 儀器和試劑

高效液相色譜儀（ACQUITY Arc，Waters 公司）；十萬分之一電子天平（AB265-S，METTLER TOLEDO）；25-OH-D3標(biāo)準(zhǔn)品購自德國(guó)Dr. Ehrenstorfer 公司，純度98.2%，批號(hào)G155330；甲醇為色譜純；實(shí)驗(yàn)用水為一級(jí)水；復(fù)合預(yù)混合飼料樣收集于市場(chǎng)。

1.2 色譜條件

色譜柱型號(hào)為Thermo AQUASIL-C18（100 mm×3.0 mm，粒徑3 μm），柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)264 nm；流速為0.6 mL/min；50 μL 進(jìn)樣；流動(dòng)相A 為水，流動(dòng)相B 為甲醇，按照表1 程序梯度洗脫。

表1 梯度洗脫表

1.3 樣品溶液的制備

稱取復(fù)合預(yù)混合飼料3 g（精確至0.01 mg）于50 mL 棕色容量瓶中，加入10 mL 水，超聲10 min，再加入甲醇30 mL，混勻，超聲提取20 min，冷卻后，以甲醇定容；移取30 mL 于離心管中，離心5 min（6000 轉(zhuǎn)/min），將上清液過0.22 μm 濾膜，得到樣品溶液。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液制備

稱取25-OH-D3標(biāo)準(zhǔn)品25 mg（精確至0.01 mg）于25 mL棕色容量瓶中，加入甲醇適量使25-OH-D3溶解后，用甲醇定容。保存在-20℃。

1.5 標(biāo)準(zhǔn)系列溶液制備

取標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液適量于棕色容量瓶中，以85%甲醇溶液定容，配制得到濃度分別為25 μg/mL，10 μg/mL，5 μg/mL，1 μg/mL，0.5 μg/mL，0.05 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 方法的線性與范圍

在0.05 μg/mL～25 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，以濃度（x）為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的峰面積值（y）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到線性方程y = 133091x - 4634，相關(guān)系數(shù)r=0.9999。結(jié)果表明，本法在0.05 μg/mL～25 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，線性良好。

2.2 方法的檢測(cè)限和定量限

對(duì)空白復(fù)合預(yù)混合飼料樣品進(jìn)行加標(biāo)，考察其信噪比（s/n）。選擇s/n ≥3 的濃度作為檢出限，得到檢出限為0.2 mg/kg ；選擇s/n ≥10 的濃度作為定量限，得到定量限為1 mg/kg。

2.3 方法的準(zhǔn)確度和精密度

市場(chǎng)中復(fù)合預(yù)混合飼料中25-OH-D3含量普遍小于10 mg/kg，因此，選擇空白基質(zhì)中進(jìn)行1 mg/kg、5 mg/kg、10 mg/kg三個(gè)濃度水平的添加，進(jìn)行準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)。結(jié)果表明，各濃度平均回收率在83.3%～97.1%之間，RSD 在0.4%～2.0%之間，準(zhǔn)確度和精密度均較好，詳見表2。

表2 方法準(zhǔn)確度及精密度的試驗(yàn)結(jié)果（n=5）

2.4 樣品測(cè)定

按本方法對(duì)市場(chǎng)收集的各類復(fù)合預(yù)混合飼料樣品進(jìn)行測(cè)定，并對(duì)每個(gè)樣品進(jìn)行了相當(dāng)于本底濃度的加標(biāo)。結(jié)果表明，復(fù)合預(yù)混合飼料中25-OH-D3的含量在2.5 mg/kg ～10.5 mg/kg之間，本底加標(biāo)回收率在86.7% ～97.0%之間，結(jié)果見表3。

表3 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果數(shù)據(jù)表（n=3）

3 結(jié)論

本文所建方法的線性、檢出限、定量限、準(zhǔn)確度與精確度均能滿足復(fù)合預(yù)混合飼料中25-OH-D3測(cè)定要求。