“雙固一通”艾灸法對(duì)糖尿病及糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠海馬BDNF和NT-3蛋白的影響

曾林 ，向婷 ，王天沛 ，胡霞 ，唐宏圖 ，4

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，武漢 430061;2.中國(guó)解放軍廣州軍區(qū)武漢總醫(yī)院，武漢 430070;3.湖北中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，武漢 430065;4.針灸治未病湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，武漢 430061)

糖尿病(diabetes mellitus， DM)是胰島素分泌的缺陷或(和)胰島素作用障礙所導(dǎo)致的一組以慢性高血糖為特征的代謝性疾病。DM以高血糖為主要標(biāo)志，誘發(fā)各種嚴(yán)重的并發(fā)癥，是DM致死、致殘的主要原因[1]。DM已成為全世界許多國(guó)家的常見病和多發(fā)病，其病死率已居腫瘤、心血管病之后的第3位，是工業(yè)發(fā)達(dá)國(guó)家中僅次于癌癥、艾滋病和心血管疾病之后需優(yōu)先考慮的疾病[2]。據(jù)國(guó)家衛(wèi)生部調(diào)查顯示，我國(guó)每天新增 DM患者3000例，每年約增加120萬[3]。糖尿病周圍神經(jīng)病(diabetic peripheral neuropathy， DPN)是 DM 常見并發(fā)癥，近年來，隨著DM發(fā)病率的提高，其周圍神經(jīng)病變的發(fā)病率也明顯增多。據(jù)統(tǒng)計(jì)，DPN的發(fā)生率高達(dá)60%～90%[4]。有相關(guān)研究表明，糖尿病患者體內(nèi)缺乏神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及其相關(guān)受體，從而導(dǎo)致了 DPN的發(fā)生[5]。而且另有學(xué)者指出，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在神經(jīng)修復(fù)的過程中起著重要作用[6]，因此缺乏此類因子也是多數(shù)神經(jīng)損傷不可逆轉(zhuǎn)的主要原因之一。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)DM、DPN大鼠血糖及其海馬組織的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor， BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(neurotrophin-3， NT-3)蛋白表達(dá)的觀察，擬探討艾灸對(duì)防治DM及DPN的作用機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選擇的 SPF級(jí)雄性 SD大鼠 105只，體質(zhì)量為(200±20)g(3月齡)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物由湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào) syxk(鄂)2017-0067]提供。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，再行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)過程完全符合《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)性意見》的相關(guān)規(guī)定。

1.2 主要試劑及儀器

鏈尿佐菌素(S0130，Sigma公司，美國(guó))，BDNF抗體(ab108319，Abcam 公司，美國(guó))，NT3 抗體(ab216491，Abcam公司，美國(guó))，KD-YS3A生物組織自動(dòng)脫水機(jī)(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)，KL-Ⅰ型生物組織自動(dòng)包埋機(jī)(湖北康龍電子科技有限責(zé)任公司)，F(xiàn)inesse325旋轉(zhuǎn)石蠟切片機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)，BX53型生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)，AWL-1001-M艾科浦超純水機(jī)(美國(guó)艾科浦國(guó)際有限公司)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)用艾條(河南南陽漢方艾葉有限公司)，ONE TOUCH穩(wěn)豪?倍易型血糖儀(美國(guó)強(qiáng)生公司)，HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)(武漢千屏影像技術(shù)有限公司)。

1.3 模型制備

采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)選取 15只大鼠作為正常對(duì)照，另90只大鼠禁食不禁水12 h后，左下腹腔注射鏈脲佐菌素[7]，劑量為 50 mg/kg體質(zhì)量。注射完成后72 h開始測(cè)血糖，凡血糖水平在16.7 mmol/L以上者列為DM模型大鼠[8]。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組和處理

從造模成功的75只DM模型大鼠中采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)抓取30只，并再次采用隨機(jī)數(shù)字表法均分為B組和C組，每組15只;剩余45只DM模型大鼠繼續(xù)正常喂養(yǎng)4周，測(cè)定感覺或運(yùn)動(dòng)傳導(dǎo)速度減慢超過11%即成DPN大鼠模型[9]，共30只，再采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)均分為D組和E組，每組15只。

A組:正常對(duì)照，不造模，不治療。

B組:DM模型組，造模成功后不行艾灸治療，正常喂養(yǎng)。

C組:DM艾灸治療組，造模成功后，取大鼠關(guān)元，雙側(cè)足三里、胰俞穴[10]，用0.5 cm×15 cm的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用艾條對(duì)各穴位先后進(jìn)行懸灸，艾條距離穴位約5 cm，每穴15 min，每日1次，連續(xù)治療4周后取材檢測(cè)。

D組:DPN模型組，不行艾灸治療，正常喂養(yǎng)。

E組:DPN艾灸治療組，治療方法同C組。

1.5 指標(biāo)觀察與檢測(cè)

1.5.1 血糖檢測(cè)

于造模后72 h、4周治療結(jié)束后和8周治療結(jié)束后空腹尾靜脈采血，用強(qiáng)生血糖儀及配套試紙檢測(cè)血糖。

1.5.2 BDNF和NT-3蛋白免疫組化檢測(cè)

4周治療結(jié)束后和8周治療結(jié)束后，用10%水合氯醛將各組大鼠麻醉，迅速斷頭取大腦，剝離海馬部分置于4%的多聚甲醛固定液中固定。常規(guī)石蠟包埋、切片，貼片后于60℃烘片3 h備用。

免疫組化DAB法檢測(cè)海馬組織BDNF和NT-3蛋白的表達(dá)水平，具體步驟為脫蠟，PBS浸洗3 min×3次，用微波輻射抗原修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù)，而后等待其自然降至常溫，用 0.3%過氧化氫甲醇液阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，PBS浸洗 5 min×3次，10%正常山羊血清室溫封閉10 min，甩去血清滴加1:250倍稀釋的兔抗BDNF、NT-3單/多克隆抗體，4℃孵育過夜，PBS浸洗5 min×3次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗IgG多聚體，37℃孵育45 min，PBS浸洗5 min×3次。用新鮮配制的DAB顯色液顯色，在顯微鏡下控制顯色時(shí)間，用PBS終止反應(yīng)，蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精分化，水洗返藍(lán)，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片晾干，鏡檢拍照。圖片分析采用 HPIAS-1000高清晰彩色病理圖文分析系統(tǒng)進(jìn)行圖像分析。每鼠取切片5張，400倍鏡下檢測(cè)各片的平均光密度值(density)，分別測(cè)定，累加取其平均值，即為該鼠density值。終值單位為像素點(diǎn)，檢測(cè)場(chǎng)面積為15萬個(gè)像素點(diǎn)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，各組治療前后比較運(yùn)用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，組間比較運(yùn)用單因素方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠治療前后血糖比較

B組、D組與 A組比較，血糖水平明顯升高(P＜0.05);C組與B組比較，大鼠在治療后血糖水平均降低(P＜0.05);E組與D組比較，大鼠在治療后血糖水平均降低(P＜0.05)，詳見表1。

表1 各組大鼠治療前后血糖比較 (±s，mmol/L)

表1 各組大鼠治療前后血糖比較 (±s，mmol/L)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與D組比較3)P＜0.05

組別 n 72 h 4 w 8 w A 組 15 4.78±0.83 5.14±1.08 5.08±0.93 B組 15 19.23±1.421) 23.25±2.181) -C組 15 21.34±2.061) 13.68±2.891)2) -D 組 15 21.73±3.151) 23.58±2.191) 26.39±2.371)E 組 15 20.65±2.721) 22.46±3.481) 13.87±2.571)3)

2.2 各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)比較

正常大鼠海馬BDNF蛋白陽性表達(dá)呈棕色，B組和D組大鼠陽性表達(dá)均減少，經(jīng)“雙固一通”灸法防治后，C組和E組大鼠的BDNF蛋白陽性表達(dá)均明顯增加，詳見圖1。

圖1 各組大鼠海馬組織BDNF蛋白表達(dá)比較(×400)

表2 各組大鼠BDNF免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

表2 各組大鼠BDNF免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與D組比較3)P＜0.05

組別 n 4 w 8 w A組 15 24.36±0.15 24.87±0.34 B組 15 12.16±0.081) -C組 15 18.52±0.432) -D組 15 - 9.56±1.321)E組 15 - 16.58±0.643)

B組、D組大鼠海馬BDNF免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值較A組明顯減少(P＜0.05);與B組比較，C組大鼠 BDNF免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值明顯增加(P＜0.05);與D組比較，E組大鼠BDNF免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值明顯增加(P＜0.05)，詳見表2。

2.3 各組大鼠海馬組織NT-3蛋白表達(dá)比較

正常大鼠NT-3蛋白陽性表達(dá)呈棕色，B組和D組大鼠陽性表達(dá)均減少，經(jīng)“雙固一通”灸法防治后，C組和E組大鼠的NT-3蛋白陽性表達(dá)均明顯增加，詳見圖2。

圖2 各組大鼠海馬組織中NT-3蛋白表達(dá)比較(×400)

B組、D組大鼠海馬NT-3免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值較A組明顯減少(P＜0.05);與B組比較，C組大鼠 NT-3免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值明顯增加(P＜0.05);與D組比較，E組大鼠NT-3免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值明顯增加(P＜0.05)，詳見表3。

表3 各組大鼠NT-3免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

表3 各組大鼠NT-3免疫陽性神經(jīng)元平均光密度值比較(±s，OD/mm2)

注:與A組比較1)P＜0.05;與B組比較2)P＜0.05;與D組比較3)P＜0.05

A組 15 38.56±0.05 38.34±0.32 B組 15 11.32±0.061) -C組 15 24.51±0.232) -D組 15 - 8.68±0.821)E組 15 - 20.36±0.583)

3 討論

中醫(yī)學(xué)將糖尿病(DM)稱之為“消渴”。糖尿病周圍神經(jīng)病(DPN)在古醫(yī)籍中無確切的病名，但長(zhǎng)期以來DPN與“消渴”都是密切聯(lián)系在一起的?！饵S帝內(nèi)經(jīng)》時(shí)期已對(duì)消渴的病因、病機(jī)、癥狀等有了較為詳細(xì)的記載?！秲?nèi)經(jīng)》明確地指出消渴病因?yàn)椤按朔拭乐l(fā)也，引人必?cái)?shù)食甘美多肥也。肥者令人內(nèi)熱，甘者令人中滿，故其氣上溢，轉(zhuǎn)為消渴”，這些論述與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為飲食失控可誘發(fā)糖尿病的理論十分吻合。唐初著名醫(yī)家甄立言《古今錄驗(yàn)方》記載消渴臨床癥狀為“渴而飲水多，小便數(shù)，無脂似麩片甜”，王燾在《外臺(tái)秘要》中指出“消渴者，每發(fā)小便至甜”。《素問·太陰陽明論》:“脾病不能為胃行其津液，四肢不得稟水谷之氣，氣日以衰，脈道不利，筋骨肌肉皆元?dú)庖陨！闭f明 DPN的臨床表現(xiàn)是以四肢麻木不仁為主;而脾虛化生津液不足，營(yíng)陰虧耗，從而引起氣血虧虛，不能濡養(yǎng)筋脈而導(dǎo)致四肢不溫而痛;氣虛血行不暢，久而成瘀。

中醫(yī)學(xué)“治未病”以正氣為本，固護(hù)先天和后天是其基礎(chǔ)和關(guān)鍵，通過“治”達(dá)到“防”的目的，“治”是積極的、主動(dòng)的“防”?！胺馈钡囊饬x有三，一是預(yù)防疾病，二是療疾防變，三是調(diào)節(jié)機(jī)能。中醫(yī)學(xué)“治未病”的本質(zhì)特征是“固護(hù)正氣、以治為防”[11]?！半p固”即固護(hù)人體先天之本和后天之本，“一通”即通瀉病邪。足三里為胃經(jīng)合穴，胃腑之下合穴，針之可調(diào)理脾胃，補(bǔ)益氣血生化之源，固護(hù)后天之本;關(guān)元為任脈腧穴，也是三陰經(jīng)與任脈交會(huì)穴，為元陰、元陽關(guān)藏出入之所，針之可益精補(bǔ)氣，扶助人體先天之本。足三里、關(guān)元配合，兼顧先天和后天，補(bǔ)益正氣，再與治療消渴的效穴胰俞相配伍，則可達(dá)到以治為防、防微杜漸的目的[12]?！半p固一通”針灸法以中醫(yī)發(fā)病學(xué)和防治學(xué)理論為基礎(chǔ)，堅(jiān)持“未病先防，既病防變”的治療原則，注重調(diào)動(dòng)機(jī)體整體的潛在能力，以治為防，防治結(jié)合[13]。

灸法在對(duì) DM及其并發(fā)癥的防治方面也有極為豐富的記載。古文獻(xiàn)《千金翼方》載:“消渴咽喉干，灸胃管下俞三穴各百壯，穴在背第八椎下橫三寸，間寸灸之?！庇钟小笆巢怀漯嚲娜铩敝f。在現(xiàn)代臨床研究方面，對(duì)DPN患者采用雷火灸法[14-15]、溫針灸[16]可明顯改善患者的生活質(zhì)量。也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在治療 DPN上，運(yùn)用溫和灸治療后患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、一氧化氮、丙二醛和血漿內(nèi)皮素均有明顯改善，且與西藥組有明顯差異[17]。亦有報(bào)道稱通過溫針灸法可以顯著改善DPN患者中醫(yī)證候積分、Toronto量表評(píng)分，提高神經(jīng)傳導(dǎo)速度[18]。在現(xiàn)代動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面，趙永等[19]觀察到“雙固一通”灸法可對(duì)模型大鼠的血清中的TNF-α和 IL-6的含量起到良性調(diào)節(jié)的作用。另有學(xué)者[20-21]研究表明艾灸可更有效地清除自由基，發(fā)揮胰島素(INS)的作用，改善患者的代謝狀態(tài)。

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(neurotrophic factors， NTFs)是一類在靶組織內(nèi)合成，并逆行運(yùn)輸至效應(yīng)神經(jīng)元的能對(duì)中樞和周圍神經(jīng)發(fā)揮營(yíng)養(yǎng)作用的小分子肽類物質(zhì)和蛋白質(zhì)[22]。而NTFs的缺乏被認(rèn)為是DPN的發(fā)生的主要原因[23]。在神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)研究較多，其功能為維持神經(jīng)的功能和形態(tài)、修復(fù)神經(jīng)損傷，還能促進(jìn)胰島的正常發(fā)育和功能維持，當(dāng)DPN發(fā)生時(shí)，體內(nèi) NGF水平下降，引起神經(jīng)軸突運(yùn)轉(zhuǎn)異常，影響神經(jīng)正常功能[24]。近來發(fā)現(xiàn)腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素-3(NT-3)對(duì)中樞和周圍神經(jīng)組織有廣泛作用，對(duì)神經(jīng)元發(fā)育有促進(jìn)作用，并能使受損神經(jīng)元免于凋亡[25]。BDNF和NT-3是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子家族中重要成員，它們與NGF有50%同源性[26]。BDNF對(duì)在體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元發(fā)育、成年后運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活及病變運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元存活和軸突再生有著十分重要的作用[27-30]。李昌琪等[31]在小鼠坐骨神經(jīng)壓榨損傷后，腹腔注射 BDNF抗體中和內(nèi)源 BDNF，證實(shí)了小鼠坐骨神經(jīng)損傷后內(nèi)源性BDNF可參與脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元內(nèi)突觸素Ⅰ mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)。張力等[32]也發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性BDNF對(duì)周圍神經(jīng)的再生和髓化起重要作用。在Wobler小鼠模型中(運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元疾病)，外源性BDNF可阻滯運(yùn)動(dòng)功能失調(diào)，并減少去神經(jīng)支配的肌肉萎縮和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元軸突的丟失。因此，BDNF在受損運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的修復(fù)中起重要作用[33]。NT-3主要分布在大腦海馬，在骨骼肌中也大量存在，對(duì)支配肌肉的感覺神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元都發(fā)揮著營(yíng)養(yǎng)作用。NT-3可以調(diào)節(jié)神經(jīng)元的活動(dòng)以及促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)，NT-3缺乏或含量不足時(shí)，會(huì)對(duì)學(xué)習(xí)記憶等功能產(chǎn)生影響，并與阿爾茨海默病等神經(jīng)退行性病變密切相關(guān)。以往的許多研究已證實(shí)DM可以引起周圍神經(jīng)系統(tǒng)NT-3合成和運(yùn)輸下降[34]。NT-3能夠促進(jìn)神經(jīng)元存活，阻止神經(jīng)元損傷后死亡，促進(jìn)神經(jīng)元修復(fù)和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)傳遞等功能，并可以逆轉(zhuǎn)受損神經(jīng)元的萎縮，使損傷部位存活的神經(jīng)元增多[35]。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過“雙固一通”艾灸法治療后，模型大鼠的血糖明顯下降，發(fā)揮了其降糖的作用，而且發(fā)現(xiàn)模型組大鼠海馬中BDNF和NT-3蛋白表達(dá)的數(shù)量明顯降低，DM及 DPN嚴(yán)重?fù)p傷了大鼠神經(jīng)功能;而 DM和DPN治療組中，二者BDNF和NT-3蛋白的表達(dá)顯著增加，因此，“雙固一通”艾灸法通過影響B(tài)DNF和NT-3的產(chǎn)生，保護(hù)糖尿病大鼠的感覺神經(jīng)元，對(duì)糖尿病及并發(fā)癥周圍神經(jīng)病變起到治療作用。