高溫脅迫下硒硫互作調(diào)控西蘭花芽苗生理及蘿卜硫素代謝研究

韓 宇 朱振宇 沈敏熙 程雨薇 尹永祺 方維明

(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

硫代葡萄糖苷(簡(jiǎn)稱硫苷)是一類含氮和硫的次生代謝產(chǎn)物。 西蘭花中含有豐富的蘿卜硫苷(glucoraphanin，GRA)，其經(jīng)黑芥子酶(myrosinase，MYR)作用水解生成蘿卜硫素[1-2]。 蘿卜硫素是目前發(fā)現(xiàn)最強(qiáng)的天然抗癌成分之一[3]，它能夠抑制體內(nèi)階段I 相致癌酶的產(chǎn)生，誘導(dǎo)產(chǎn)生階段II 相解毒酶競(jìng)爭(zhēng)性抑制化學(xué)致癌基因表達(dá)[4]，使致癌物失活排除體外，從而保護(hù)體內(nèi)大分子不受損傷。 此外，蘿卜硫素還具有抗氧化[5]及抑制炎癥等[6]多種生理作用。 西蘭花芽苗是一種潛在的天然功能性蔬菜，富含礦物質(zhì)、維生素和次生代謝物，能夠降低慢性疾病的發(fā)生，對(duì)人類健康有益[7]，因而受到廣泛關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn)，西蘭花遭受逆境脅迫時(shí)會(huì)啟動(dòng)防御機(jī)制及脅迫應(yīng)激反應(yīng)，大量積累硫苷以抵御脅迫造成的損傷[8]。 硫苷合成相關(guān)基因的表達(dá)在很大程度上也受植物生長(zhǎng)環(huán)境因素，如溫度、光照及輻射等的影響，進(jìn)而影響硫苷含量[9]。 外源施硫已被證實(shí)是富集蘿卜硫素的有效手段。 此外，硒是維持人體正常新陳代謝所必需的元素，如果供應(yīng)不足，會(huì)導(dǎo)致相關(guān)病理癥狀[10]，研究發(fā)現(xiàn)甲基化的含硒化合物可預(yù)防腫瘤[11]。研究顯示，適當(dāng)?shù)奈幚頃?huì)增加西蘭花中硒代氨基酸、硫苷及蘿卜硫素等含量[12]。 同時(shí)，熱激、低氧及外源茉莉酸、脫落酸處理均可促進(jìn)蘿卜硫素的富集[8]。 然而，高溫脅迫尤其是高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗生理及蘿卜硫素代謝的影響尚鮮見報(bào)道。

本研究以西蘭花為試材，研究高溫脅迫硒硫互作處理下西蘭花芽苗主要生理生化和蘿卜硫素代謝的變化，以期從生理生化代謝及基因水平探討高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗中GRA 和蘿卜硫素的調(diào)控機(jī)制，為開發(fā)富含蘿卜硫素的功能性食品提供理論依據(jù)，推動(dòng)芽苗菜的工業(yè)化發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 供試材料

西蘭花(Brassica oleraceaL.)種子品種為優(yōu)秀，購(gòu)于2018 年，產(chǎn)自日本坂田公司，封裝于密閉容器中，4℃保存?zhèn)溆?；亞硒酸鈉、烯丙基硫苷(純度＞95%)、蘿卜硫素(純度＞99%)生化試劑、乙腈，色譜純，均購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；1，2-苯二硫醇(純度＞99%)生化試劑，購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。 RNA 反轉(zhuǎn)錄 試劑 盒(RR047A)、 TB Green Premix Dimer Eraser(RR091A)，均購(gòu)自日本TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品制備 稱取西蘭花種子24 g，置于100 mL 1%(v/v)NaClO 水溶液中，20℃浸泡消毒15 min，然后用蒸餾水沖洗種子至pH 值中性，再于蒸餾水中30℃浸泡4 h，隨后置于鋪有蛭石的透明盒中，于pGX-150 型智能光照培養(yǎng)箱(寧波海曙賽福實(shí)驗(yàn)儀器廠)內(nèi)30℃發(fā)芽，16 h 光照/8 h 黑暗，分別設(shè)置以下處理:1)對(duì)照:4 mmol·L-1ZnSO4，記作S；2)Na2SeO3處理:0.1 mmol·L-1Na2SeO3記作Se；3)ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理:4 mmol·L-1ZnSO4＋0.1 mmol·L-1Na2SeO3，記作SSe；4)高溫聯(lián)合ZnSO4處理:60℃熱激20 min，4 mmol·L-1ZnSO4，記作HS；5)高溫聯(lián)合Na2SeO3處理:60℃熱激20 min，0.1 mmol·L-1Na2SeO3，記作HSe；6)高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理:60℃熱激20 min，4 mmol·L-1ZnSO4＋0.1 mmol·L-1Na2SeO3，記作HSSe。

芽苗共發(fā)芽6 d，第1 天均噴施20 mL 去離子水催芽，之后每隔24 h 將高溫處理芽苗置于60℃恒溫箱熱激處理20 min[8，13]，并對(duì)不同處理組分別噴施20 mL不同處理液至培養(yǎng)結(jié)束，發(fā)芽4 和6 d 時(shí)取樣測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.2.1 形態(tài)特征 從各處理組中隨機(jī)選取10 株西蘭花芽苗，擺放整齊后，用相機(jī)拍其形態(tài)特征。

1.2.2.2 芽長(zhǎng)及鮮重 隨機(jī)選取30 株西蘭花芽苗，用游標(biāo)卡尺測(cè)定其芽長(zhǎng)，并用精密電子天平稱量鮮重，計(jì)算單株芽苗鮮重。

1.2.2.3 硒元素含量 取5 g 芽苗，利用Delta 1-24 LSC 冷凍干燥機(jī)(德國(guó)Christ 公司)制備芽苗凍干樣，再利用研缽將芽苗凍干樣研磨成粉未狀。 取芽苗凍干樣品粉末0.1 g 于微波消解內(nèi)罐中，加入5 mL 濃硝酸，加蓋放置1 h，旋緊罐蓋，按照MWD-520 微波消解儀(上海元析儀器有限公司)標(biāo)準(zhǔn)操作步驟進(jìn)行消解，消解完成冷卻后，揮發(fā)硝酸至0.5 mL，超純水定容至10 mL 后用Optima 7300 DV 電感耦合等離子體光譜儀(美國(guó)PerkinElmer 公司)測(cè)定硒元素含量。

1.2.2.4 總抗氧化能力及丙二醛含量 利用總抗氧化能力(T-AOC)試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定總抗氧化能力，參照硫代巴比妥酸法[14]測(cè)定丙二醛含量。

1.2.2.5 硫苷含量 參照Wei 等[15]的方法并稍做修改。 取0.2 g 芽苗，加入2 mL 75%煮沸甲醇，80℃恒溫水浴中浸提15 min，10 000×g離心10 min，取上清依次加入1 mL 8 mmol·L-1氯化鈀顯色液、2 mL 0.15%羧甲基纖維素鈉溶液，室溫下顯色6 h 后于540 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.2.2.6 黑介子酶活性 參照Burow 等[16]的方法并稍做修改。 取0.2 g 芽苗，加3 mL 0.1 mol·L-1pH 值6.5 磷酸鹽緩沖液冰浴研磨，4℃條件下10 000×g離心15 min，取上清液并利用蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定其蛋白質(zhì)含量。 另取0.5 mL上清液與0.5 mL 0.25 mmol·L-1烯丙基硫苷溶液混合，于37℃水浴反應(yīng)15 min 后置于沸水5 min，并利用葡萄糖測(cè)定試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定葡萄糖含量。 以每分鐘被黑芥子酶轉(zhuǎn)化生成1 nmol葡萄糖為1 個(gè)酶活力單位(U·mg-1protein)。

1.2.2.7 異硫氰酸酯含量 參照J(rèn)iao 等[17]的方法并稍做修改。 取0.2 g 芽苗，加3 mL 蒸餾水研磨，勻漿液置于40℃水浴3 h，再加入3 mL 二氯甲烷震蕩萃取30 min，10 000×g離心15 min，取下清液100 μL，依次加入2 mL 甲醇、1.8 mL 50 mmol·L-1硼酸緩沖液和0.2 mL 7 mmol·L-11，2-苯二硫醇的甲醇溶液，將混合液于65℃水浴反應(yīng)1 h 后，于365 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度值。

1.2.2.8 蘿卜硫素含量 參照郭麗萍[8]的方法測(cè)定。

1.2.3 蘿卜硫素形成關(guān)鍵基因表達(dá) 按照植物RNA提取試劑盒(美國(guó)OMEGA 公司)說(shuō)明書提取RNA，參考郭麗萍[8]、Ramos 等[18]進(jìn)行引物設(shè)計(jì)(表1)。 參考郭麗萍[8]的熒光定量PCR 體系及反應(yīng)條件，檢測(cè)各基因的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理

試驗(yàn)設(shè)3 次重復(fù)，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)分析軟件18.0(SPSS 18.0)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，均值間采用Tukey 法進(jìn)行多重比較[19]，在0.05 水平上進(jìn)行顯著檢驗(yàn)(P＜0.05)，基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法[20]計(jì)算。

表1 西蘭花芽苗相關(guān)基因引物序列Table 1 Related genes primer sequences of broccoli sprouts

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗生理代謝的影響

2.1.1 形態(tài)特征 由圖1 可知，西蘭花芽苗經(jīng)高溫處理后，其生長(zhǎng)狀較未經(jīng)高溫處理均受到影響，且發(fā)芽6 d 時(shí)經(jīng)高溫聯(lián)合ZnSO4處理(HS)的西蘭花芽苗受脅迫情況更嚴(yán)重，相較于對(duì)照(S)其芽苗及葉片大小均明顯受到抑制，而經(jīng)高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理(HSSe)的芽苗及葉片大小相較于對(duì)照均無(wú)明顯差異。 相較于高溫聯(lián)合ZnSO4處理，發(fā)芽4 d 時(shí)高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理的西蘭花芽苗葉片明顯增大。

圖1 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗形態(tài)表征的影響Fig.1 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on morphological characterization of broccoli sprouts under high temperature stress

2.1.2 芽長(zhǎng)及鮮重 由圖2 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗的芽長(zhǎng)及鮮重均隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，發(fā)芽6 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理下芽苗的芽長(zhǎng)及鮮重均顯著低于對(duì)照(P＜0.05)。 發(fā)芽6 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗芽長(zhǎng)與對(duì)照無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但芽苗的芽長(zhǎng)及鮮重均顯著高于高溫聯(lián)合ZnSO4處理組(P＜0.05)，分別為高溫聯(lián)合ZnSO4處理組的1.24 和1.17 倍。 上述結(jié)果表明，Na2SeO3能在一定程度上緩解高溫聯(lián)合ZnSO4處理對(duì)西蘭花芽苗的生長(zhǎng)抑制作用。

2.1.3 硒元素含量 由圖3 可知，發(fā)芽期間除ZnSO4及高溫聯(lián)合ZnSO4處理組，其他4 個(gè)處理組西蘭花芽苗中硒元素含量整體均隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)顯著上升(P＜0.05)。 發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理的芽苗中硒元素含量相較對(duì)照無(wú)顯著差異(P＞0.05)；而高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組的芽苗中硒元素含量較對(duì)照及高溫聯(lián)合ZnSO4處理組均顯著提高(P＜0.05)，其含量分別為對(duì)照和高溫聯(lián)合ZnSO4處理組的63.35、57.63 倍。 發(fā)芽6 d 時(shí)，各處理組芽苗中硒元素含量均較對(duì)照和高溫聯(lián)合ZnSO4處理組顯著提高(P＜0.05)。

圖2 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗芽長(zhǎng)(A)及鮮重(B)的影響Fig.2 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on the sprout length (A) and fresh weight (B) of broccoli sprouts under high temperature stress

圖3 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗硒元素含量的影響Fig.3 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on selenium content of broccoli sprouts under high temperature stress

2.1.4 總抗氧化能力及丙二醛含量 由圖4 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗中總抗氧化能力及丙二醛含量均隨著發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)而下降。 發(fā)芽4 和6 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理組芽苗的總抗氧化能力及丙二醛含量均較對(duì)照顯著增加(P＜0.05)。 發(fā)芽6 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗的總抗氧化能力及丙二醛含量均較高溫聯(lián)合ZnSO4處理組顯著下降(P＜0.05)。 發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理組與高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗的總氧化能力及丙二醛含量均無(wú)顯著差異(P＞0.05)，但均顯著高于對(duì)照(P＜0.05)，其丙二醛含量分別是對(duì)照的1.59 和1.41 倍。 綜上可知，芽苗經(jīng)高溫聯(lián)合ZnSO4處理后其生長(zhǎng)受到抑制，而高溫脅迫下硒硫互作可在一定程度上緩解這種抑制作用。

2.2 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗蘿卜硫素代謝指標(biāo)的影響

2.2.1 硫苷含量 由圖5 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗中硫苷含量均隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中硫苷含量較對(duì)照處理顯著提高(P＜0.05)，而對(duì)照與高溫聯(lián)合ZnSO4處理組芽苗中硫苷含量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 發(fā)芽6 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理組與高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中硫苷含量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，其硫苷含量分別是對(duì)照的1.34 和1.35 倍。 結(jié)果表明，發(fā)芽4 d 時(shí)，西蘭花芽苗經(jīng)高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理可顯著提高硫苷含量。

圖5 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗硫苷含量的影響Fig.5 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on glucosinolate content of broccoli sprouts under high temperature stress

圖4 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗總抗氧化能力(A)及丙二醛含量(B)的影響Fig.4 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on total antioxidant capacity (A) and malondialdehyde content (B) of broccoli sprouts under high temperature stress

2.2.2 黑介子酶活性 由圖6 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗中黑介子酶活性均隨著發(fā)芽時(shí)間延長(zhǎng)而降低。 發(fā)芽4 d 和6 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗的黑介子酶活性較對(duì)照及高溫聯(lián)合ZnSO4處理組均顯著提高(P＜0.05)，發(fā)芽4 d 時(shí)高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗的黑介子酶活性達(dá)336.32 U·mg-1protein；對(duì)照與高溫聯(lián)合ZnSO4處理組芽苗的黑介子酶活性均無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果表明，高溫處理對(duì)西蘭花芽苗中黑介子酶活性無(wú)顯著影響，但高溫脅迫下硒硫互作有助于黑介子酶活性的提高，說(shuō)明Na2SeO3能在一定程度上緩解高溫聯(lián)合ZnSO4處理對(duì)西蘭花芽苗黑介子酶活性的抑制，提高黑介子酶活性。

圖6 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗黑介子酶活性的影響Fig.6 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on myrosinase activity of broccoli sprouts under high temperature stress

2.2.3 異硫氰酸酯含量 由圖7 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗中異硫氰酸酯含量均隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。 發(fā)芽4 和6 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理組與高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中異硫氰酸酯含量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，而高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中異硫氰酸酯含量與高溫聯(lián)合ZnSO4處理組無(wú)顯著差異(P＞0.05)。發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理與高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中異硫氰酸酯含量分別是對(duì)照的2.34 和2.37 倍，其中高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中硫氰酸酯含量達(dá)222.57 mg·100g-1FW。結(jié)果表明，高溫聯(lián)合ZnSO4處理相較對(duì)照可顯著提高西蘭花芽苗中異硫氰酸酯含量，而高溫脅迫下硒硫互作相較高溫聯(lián)合ZnSO4處理對(duì)芽苗中異硫氰酸酯含量的提高無(wú)顯著作用。

圖7 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗異硫氰酸酯含量的影響Fig.7 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on isothiocyanate content of broccoli sprouts under high temperature stress

圖8 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗蘿卜硫素含量的影響Fig.8 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on sulforaphane content of broccoli sprouts under high temperature stress

2.2.4 蘿卜硫素含量 由圖8 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量均隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。 發(fā)芽4 和6 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理組與高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中蘿卜硫素含量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，且高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中蘿卜硫素含量顯著高于高溫聯(lián)合ZnSO4處理組(P＜0.05)。 發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組與高溫聯(lián)合ZnSO4處理組芽苗中蘿卜硫素含量分別是對(duì)照的1.39和1.31 倍。 結(jié)果表明，高溫脅迫下硒硫互作可顯著提高西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量，且發(fā)芽4 d 時(shí)芽苗中蘿卜硫素含量最高，達(dá)149 mg·100g-1FW。

2.3 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗關(guān)鍵基因表達(dá)的影響

由圖9 可知，發(fā)芽期間各處理組西蘭花芽苗中各關(guān)鍵基因相對(duì)表達(dá)量均隨著發(fā)芽時(shí)間的延長(zhǎng)而降低。發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫聯(lián)合ZnSO4處理組與高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中MYB28、UGT74B1及ST5b的表達(dá)量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，但BoHMT1 的表達(dá)量卻較對(duì)照顯著下降(P＜0.05)。 發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組芽苗中MYB28 和BoHMT1 的表達(dá)較高溫聯(lián)合ZnSO4處理顯著提高(P＜0.05)，但UGT74B1 的表達(dá)量較高溫聯(lián)合ZnSO4處理組顯著下降(P＜0.05)，兩處理組之間ST5b的表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 發(fā)芽4 d 時(shí)，高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理組與高溫聯(lián)合ZnSO4處理芽苗中轉(zhuǎn)錄因子MYB28 的相對(duì)表達(dá)量分別是對(duì)照的3.42 和2.34 倍。 發(fā)芽6 d 時(shí)，MYB28 的相對(duì)表達(dá)量在對(duì)照、高溫聯(lián)合ZnSO4處理組及高溫脅迫下ZnSO4聯(lián)合Na2SeO3處理這3 個(gè)處理間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。 結(jié)果表明，發(fā)芽4 d 時(shí)高溫脅迫下硒硫互作可顯著提高西蘭花芽苗中相關(guān)基因表達(dá)，從而有效實(shí)現(xiàn)芽苗中蘿卜硫素的富集。

圖9 高溫脅迫下硒硫互作對(duì)西蘭花芽苗MYB28(A)、UGT74B1(B)、ST5b(C)及BoHMT1(D)基因表達(dá)的影響Fig.9 Effects of ZnSO4 and Na2SeO3 interaction on the expression of MYB28 (A)， UGT74B1 (B)，ST5b (C) and BoHMT1 (D) genes of broccoli sprouts under high temperature stress

3 討論

在鹽[21]、冷害、高溫、低氧等逆境脅迫下，植物的生物膜會(huì)受到嚴(yán)重?fù)p傷，導(dǎo)致活性氧代謝失衡，同時(shí)影響植物體內(nèi)的大分子物質(zhì)代謝，從而影響植物的正常生長(zhǎng)和發(fā)育[22-23]。 一般陸生高等植物熱害界限溫度大于35℃，脅迫時(shí)間越短植物忍耐的溫度越高。 本研究中，西蘭花發(fā)芽期間經(jīng)60℃高溫聯(lián)合ZnSO4處理后，芽苗生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，植株生長(zhǎng)形態(tài)較小，芽長(zhǎng)顯著降低(P＜0.05)，但芽苗經(jīng)高溫脅迫下硒硫互作處理后，其芽長(zhǎng)和鮮重均顯著提高(P＜0.05)，表明Na2SeO3能在一定程度上緩解高溫聯(lián)合ZnSO4處理對(duì)西蘭花芽苗生長(zhǎng)的抑制作用。 植物器官衰老或在逆境下遭受傷害，導(dǎo)致細(xì)胞膜膜脂過(guò)氧化，丙二醛是膜脂過(guò)氧化的最終分解產(chǎn)物，其含量可以反映植物遭受逆境傷害的程度，同時(shí)，丙二醛的產(chǎn)生還能加劇膜的損傷，間接反映植物組織的抗氧化能力[14]。 西蘭花芽苗經(jīng)高溫脅迫下硒硫互作處理后，芽苗丙二醛含量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，說(shuō)明高溫脅迫下硒硫互作導(dǎo)致西蘭花芽苗膜損傷嚴(yán)重。 Pe~nas 等[24]和Tian 等[25]發(fā)現(xiàn)適宜濃度硒處理可提高西蘭花芽苗抗氧化能力，本研究同樣發(fā)現(xiàn)高溫脅迫下硒硫互作處理后芽苗抗氧化能力增強(qiáng)。

非生物脅迫，如干旱、鹽、CO2濃度增加等能夠引起植物損傷，并誘導(dǎo)次生代謝產(chǎn)物的增加[26-27]。 蘿卜硫素作為十字花科植物中抗癌作用最強(qiáng)的天然活性成分[3]，備受科研工作者的關(guān)注。 本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下硒硫互作處理與高溫聯(lián)合ZnSO4處理后西蘭花芽苗中硫苷及蘿卜硫素含量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，且高溫脅迫下硒硫互作處理后西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量顯著高于高溫聯(lián)合ZnSO4處理(P＜0.05)，即高溫聯(lián)合Na2SeO3相較單獨(dú)兩種脅迫具有協(xié)同效應(yīng)。 西蘭花發(fā)芽期間經(jīng)高溫處理，同時(shí)聯(lián)合噴施硒和硫是提高西蘭花芽苗中蘿卜硫素含量的有效方式。 黑介子酶是水解GRA 產(chǎn)生蘿卜硫素的關(guān)鍵酶。本研究中高溫脅迫下硒硫互作處理的西蘭花芽苗中黑介子酶活性較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)，這與芽苗中蘿卜硫素含量提高相一致，說(shuō)明高溫脅迫下硒硫互作處理可能通過(guò)提高黑介子酶活性進(jìn)而促進(jìn)蘿卜硫素富集。 本研究還發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下硒硫互作處理較對(duì)照顯著降低了硒代氨基酸合成相關(guān)基因BoHMT1 的表達(dá)(P＜0.05)。 轉(zhuǎn)錄因子MYB28 是黑芥子酶合成關(guān)鍵基因[28]，UGT74B1 和ST5b作為主要基因參與植物中硫苷的合成[29]。 擬南芥在葡萄糖處理下通過(guò)促進(jìn)MYB28 的表達(dá)從而提高了脂肪族硫苷含量[30]。 本研究結(jié)果顯示，高溫脅迫下硒硫互作處理顯著提高了西蘭花芽苗中MYB28 及UGT74B1、ST5b的轉(zhuǎn)錄水平，這可能是西蘭花芽苗積累GRA 并實(shí)現(xiàn)蘿卜硫素富集的原因。

4 結(jié)論

西蘭花芽苗發(fā)芽期間經(jīng)高溫脅迫下硒硫互作，其芽苗生長(zhǎng)發(fā)育情況較單獨(dú)硫酸鋅處理生長(zhǎng)抑制得到明顯緩解，硒元素含量顯著增加(P＜0.05)，芽苗總抗氧化能力顯著增加(P＜0.05)，MYB28、UGT74B1 及ST5b的表達(dá)量均顯著提高(P＜0.05)，但BoHMT1 的表達(dá)量顯著 下降(P＜0.05)。 高 溫 脅 迫 下ZnSO4聯(lián) 合Na2SeO3處理后西蘭花芽苗中硫苷含量、黑介子酶活性、異硫氰酸酯含量和蘿卜硫素含量均較對(duì)照顯著提高(P＜0.05)。 西蘭花芽苗經(jīng)高溫脅迫下硒硫互作處理4 d，其蘿卜硫素含量最高，表明高溫脅迫下硒硫互作是富集西蘭花芽苗中蘿卜硫素的有效方式。