山東省番茄潰瘍病病原菌的分離與鑒定

蘇曉梅　劉淑梅　李嘉琦　王施慧　侯麗霞

摘要：本試驗(yàn)對(duì)山東省內(nèi)不同地區(qū)番茄潰瘍病發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，采集具有典型癥狀的病樣，采用組織分離方法分離純化病原菌，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定。結(jié)果表明，不同地區(qū)番茄病樣分離得到的4個(gè)菌株均屬于潰瘍病菌Cmm，但致病力存在差異。本研究可為番茄潰瘍病的準(zhǔn)確鑒定和病害防治提供參考。

關(guān)鍵詞：番茄潰瘍病;Cmm;病原菌;分離鑒定

中圖分類號(hào)：S436.412.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)號(hào)：A文章編號(hào)：1001-4942（2020）05-0100-05

Abstract In this experiment， the incidence of tomato bacterial canker disease was investigated in different areas of Shandong Province. The diseased samples with classical symptom were collected， and then the pathogen was isolated by tissue-isolation method and the morphological characteristics， molecular identification and pathogenicity test were conducted. The results showed that four strains were obtained from the investigated areas in Shandong Province. All they belonged to Cmm with different pathogenicity. This research could provide references for the identification and control of tomato bacterial canker.

Keywords Bacterial canker of tomato;Cmm;Pathogen;Isolation and identification

番茄潰瘍?。╞acterial canker of tomato）是一種由細(xì)菌侵染而引起的維管束病害，病原菌為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種（Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm），可侵染辣椒、龍葵、裂葉茄及其它番茄屬植物。番茄潰瘍病的主要癥狀包括葉片邊緣壞死、葉片萎蔫至枯死;莖和葉柄出現(xiàn)褐色條斑，病斑下陷、開裂而露出髓腔，呈潰瘍狀以及維管束變褐等;果實(shí)出現(xiàn)圓形病斑，中央淺褐色、邊緣為白色暈圈，形似鳥眼狀，可聯(lián)合成不規(guī)則斑塊[1]。該病害在番茄生育期內(nèi)均可發(fā)生，特別是溫暖潮濕條件更易造成該病的大規(guī)模暴發(fā)與流行。我國(guó)于1985年首次在北京市平谷發(fā)現(xiàn)番茄潰瘍病[2]。1993年東北地區(qū)也報(bào)道了該病發(fā)生[3]。2002年，安徽省國(guó)寧市方塘鄉(xiāng)番茄潰瘍病發(fā)病率超過80%。2007—2009年，該病給貴州省修文縣造成的產(chǎn)量損失達(dá)40%～50%[4]。近年來，隨著氣候的異常變化及番茄種植規(guī)模擴(kuò)大，番茄潰瘍病在黑龍江、吉林、遼寧、內(nèi)蒙古、新疆、河北、河南、山東、上海、海南、重慶、湖北、貴州等省區(qū)均有不同程度發(fā)生，且逐年加重，這對(duì)番茄生產(chǎn)造成一定影響[1，5-8]。

本研究對(duì)山東省不同地區(qū)番茄潰瘍病田間發(fā)病情況進(jìn)行調(diào)查，采集病樣進(jìn)行病原菌分離與純化，并對(duì)分離得到的病原菌進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察、分子生物學(xué)鑒定以及致病性測(cè)定，以明確不同地區(qū)番茄潰瘍病菌的致病力差異，為番茄潰瘍病的鑒定、防治及探索該病病原菌的多態(tài)性提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試培養(yǎng)基： 523液體培養(yǎng)基：每升含10 g蔗糖、8 g水解酪素、4 g酵母浸膏、2 g K2HPO4、0.3 g MgSO4·7H2O。523固體培養(yǎng)基：在上述523液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。培養(yǎng)基用前高壓滅菌，且pH值調(diào)整為6.9～7.1。

病原菌致病性測(cè)定試驗(yàn)所用番茄品種Heinz 1706，種植于32孔穴盤，待長(zhǎng)至三葉一心時(shí)進(jìn)行處理。

1.2 田間調(diào)查及病樣采集

于2018—2019年調(diào)查山東省泰安市岱岳區(qū)、濟(jì)南市濟(jì)陽區(qū)、蒙陰縣、壽光市等地番茄潰瘍病發(fā)病情況，選擇典型病株，觀察、記錄病害癥狀，并將病樣帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行病原菌分離。

1.3 病原菌分離培養(yǎng)及形態(tài)觀察

采用常規(guī)組織分離法對(duì)病原菌進(jìn)行分離。具體步驟：使用滅菌解剖刀切取病健交界處1～2 cm莖段，先用無菌水沖洗干凈，再經(jīng)1% NaClO 溶液消毒5 min，后用無菌水清洗3次;將消毒后莖段置于滅菌培養(yǎng)皿中，加1～2滴無菌水，擠壓使組織液滲出;用滅菌接種環(huán)蘸取組織液在523固體培養(yǎng)基平板上劃線：先在平板的一側(cè)順序劃3～5條線，再將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)60°，從第二條線末端順序劃3～5條線[9]。后置于 28℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d后，挑取疑似潰瘍病菌落進(jìn)行純化培養(yǎng)，觀察、記錄菌落形狀、大小、顏色等形態(tài)特征。

1.4 病原菌分子生物學(xué)鑒定

挑取純化后菌落至523液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)12 h后，6 000 r/min離心2 min，棄上清，菌體用無菌水洗滌2次后，重懸于無菌水中備用。

以上述重懸菌體為模板，采用表1中引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系（10 μL）：菌懸液 2 μL，上、下游引物各0.25 μL，2×Taq Mix 5 μL，ddH2O 2.5 μL。反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5 min;94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán);72℃延伸5 min，16℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后送至北京六合華大基因科技有限公司測(cè)序。利用NCBI數(shù)據(jù)庫的Blast程序?qū)y(cè)序結(jié)果進(jìn)行比較。

1.5 病原菌致病性測(cè)定

將純化后各病原菌分別轉(zhuǎn)至523液體培養(yǎng)基中，28℃、200 r/min 振蕩培養(yǎng)12 h后，將各菌懸液濃度調(diào)至108～109 cfu/mL。采用打頂法接種，將手術(shù)剪前端1 cm處蘸取菌懸液，在幼苗新葉處將主莖剪斷[14]，以蘸取無菌水為對(duì)照，每份菌懸液接種8株，重復(fù)3次。接種后，先將植株置于28℃環(huán)境中（RH為90%～100%）保濕48 h，再進(jìn)行正常管理（白天25～28℃、夜晚20～22℃，平均濕度80%～90%），20 d后觀察病情發(fā)展情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 山東省不同地區(qū)番茄潰瘍病的田間發(fā)病情況

經(jīng)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)番茄病株表現(xiàn)癥狀一致，均為下部葉片先出現(xiàn)染病癥狀，后逐漸向頂端蔓延。該病進(jìn)一步擴(kuò)展時(shí)，葉柄、側(cè)枝或主莖出現(xiàn)灰褐色條斑，后期莖部略變粗、表面產(chǎn)生許多不定根或刺狀突起、開裂，髓部中空變褐，全株枯死;果實(shí)出現(xiàn)典型的“鳥眼斑”癥狀，即病斑中央產(chǎn)生黑色小斑點(diǎn)并伴有白色暈圈，多個(gè)病斑融合使果實(shí)表面粗糙（圖1）。

2.2 病原菌分離與形態(tài)學(xué)鑒定

本試驗(yàn)從不同地區(qū)番茄病樣中分離得到4株菌株。培養(yǎng)3 d后，各菌株形態(tài)基本相同：菌落呈凸圓形，黃色，表面平滑，邊緣無鋸齒，粘稠狀，直徑為1～3 mm（圖2）。根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，初步鑒定4個(gè)菌株均為番茄潰瘍病菌Cmm。

2.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

由圖3可以看出，不同引物均能擴(kuò)增出特異條帶，大小與預(yù)期一致，而對(duì)照無條帶。將引物27F/1492R擴(kuò)增得到的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，經(jīng)Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與HQ144241.1（已知Cmm序列的GeneBank登錄號(hào)）同源性達(dá)99%以上（圖4）。因此，分離獲得的病原菌為番茄潰瘍病菌Cmm。

2.4 病原菌致病性鑒定

由圖5可以看出，接種濟(jì)陽、蒙陰、壽光分離菌株的番茄幼苗明顯出現(xiàn)萎蔫、死亡癥狀。其中接種濟(jì)陽分離菌株的幼苗癥狀最重，所有植株均死亡，接種蒙陰分離菌株的幼苗癥狀次之，接種壽光分離菌株的8株幼苗中有3株萎蔫死亡、5株萎蔫，而接種岱岳分離菌株的幼苗無明顯發(fā)病癥狀，僅在接種傷口處出現(xiàn)萎蔫，個(gè)別葉片發(fā)生萎蔫。因此，不同地區(qū)的番茄潰瘍病菌株致病力強(qiáng)弱存在差異。

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)采集山東省內(nèi)主要番茄產(chǎn)區(qū)的番茄潰瘍病樣，并從中分離獲得純化菌株。根據(jù)形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，證實(shí)所得菌株均為Cmm。這與其它地區(qū)所報(bào)道[5，7]的番茄潰瘍病菌一致。然而，本研究樣本僅采自山東省，存在一定局限性。但引起番茄潰瘍病的病原菌并沒有生理小種分化，只是致病力有所差異。這與前人的研究[15-17]基本一致。因此，下一步應(yīng)擴(kuò)大采集和鑒定國(guó)內(nèi)番茄產(chǎn)區(qū)的潰瘍病菌，對(duì)其遺傳多樣性及致病性差異進(jìn)行分析。另外，番茄潰瘍病菌Cmm的測(cè)序工作已經(jīng)完成[18]，可充分利用基因組數(shù)據(jù)信息，在病原菌的致病機(jī)制和寄主的抗病機(jī)理及闡明二者互作機(jī)制方面開展研究，從而更好地為該病害防治提供參考。

近年來番茄潰瘍病已成為我國(guó)番茄生產(chǎn)的重大威脅，許多國(guó)家已將其列為檢疫性病害。目前，該病害主要以預(yù)防為主，生產(chǎn)中尚無有效防治藥劑，而培育抗病品種是有效的防治手段。本研究對(duì)番茄潰瘍病菌進(jìn)行分離鑒定以及致病力測(cè)定，這是進(jìn)行番茄潰瘍病抗性鑒定的前提，下一步還需建立完善的苗期接種鑒定體系以及篩選鑒定番茄種質(zhì)資源，更好地為番茄潰瘍病的抗病育種及利用研究奠定基礎(chǔ)。

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