HDAC9基因沉默對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性和Wnt信號(hào)通路影響

侯欣,王志偉,賈夢(mèng)英,楊芳,宋慧琴2,段永建

(河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院,河南 開(kāi)封 475001 1 腫瘤科； 2 病理科)

肺癌病死率極高[1]，尤以非小細(xì)胞肺癌為著，預(yù)后極差[2-3]。組蛋白脫乙酰酶9(HDAC9)是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，可參與機(jī)體生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程[4]，在多種癌癥中表達(dá)異常[5-7]。Wnt蛋白是生物發(fā)育過(guò)程所需的分泌型蛋白生長(zhǎng)因子[8]。癌基因可通過(guò)激活或抑制經(jīng)典的Wnt信號(hào)通路，參與腫瘤的進(jìn)程[9-11]。目前，有關(guān)HDAC9基因與非小細(xì)胞肺癌關(guān)系的研究尚不多見(jiàn)。本研究探討了HDAC9基因沉默對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性和 Wnt 信號(hào)通路的影響，以期為非小細(xì)胞肺癌發(fā)病的分子機(jī)制和臨床治療機(jī)制研究奠定理論基礎(chǔ)，從而為肺癌診療提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

體積分?jǐn)?shù)為0.10的胎牛血清(上海索寶生物科技有限公司)；DMEM培養(yǎng)基、BPMI 1640培養(yǎng)基和2.5 g/L胰蛋白酶(Hyclon公司，美國(guó))；非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株A549(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)；Lipofectamin 2000、RNA提取試劑盒(Invitrogen公司，美國(guó))；實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司)；免疫印跡(Western blot)抗體(武漢博士德公司)；CCK8試劑(Sigma公司，美國(guó))；酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(上海精密儀器儀表有限公司)；甲紫染色劑(碧云天生物技術(shù)有限公司)；鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白和碘化丙啶(上海聯(lián)邁生物工程有限公司)。

1.2 非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞培養(yǎng)

使用含體積分?jǐn)?shù)0.10的胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基，將A549培養(yǎng)在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中，待細(xì)胞達(dá)到80%融合時(shí)，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞的分組及轉(zhuǎn)染

取A549采用含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清并加入雙抗的BPMI 1640培養(yǎng)，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中孵育24 h。細(xì)胞隨機(jī)分組為：Blank組(a組，不轉(zhuǎn)染任何序列)、NC組(b組，轉(zhuǎn)染HDAC9陰性對(duì)照序列)、pcDNA-HDAC9組(c組，轉(zhuǎn)染HDAC9過(guò)表達(dá)載體)、si-HDAC9組(d組，轉(zhuǎn)染si-HDAC9)、si-HDAC9+rWnt3a組(e組，轉(zhuǎn)染沉默HDAC9同時(shí)加入Wnt信號(hào)通路激動(dòng)劑rWnt3a刺激細(xì)胞)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)至30%～50%融合時(shí)，按Lipofectamin 2000說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染細(xì)胞。培養(yǎng)24～48 h后，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)及實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1基因表達(dá)的qRT-PCR檢測(cè) 分別收集各組A549細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用RNA提取試劑盒提取RNA。分別設(shè)計(jì)HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5和GAPDH引物，交由Takara公司合成。使用Prime Script RT試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄體系10 μL，參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。取反應(yīng)液進(jìn)行熒光定量PCR，參照SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。在ABI PRISM?7300系統(tǒng)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)。以GAPDH為內(nèi)參，分別計(jì)算HDAC9、JNK、β-catenin和Wnt-5相對(duì)表達(dá)水平。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次取3個(gè)樣本。

1.4.2蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h后A549，加蛋白裂解液，離心取上清液分裝備用。測(cè)定各樣品蛋白濃度，去離子水調(diào)整，確保上樣量一致。配制100 g/L SDS分離膠與濃縮膠。樣品與加樣緩沖液混合，100 ℃煮沸5 min，冰浴、離心后進(jìn)行電泳分離，再將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。50 g/L脫脂奶粉4 ℃封膜過(guò)夜。滴加一抗(兔抗鼠多克隆抗體HDAC9、JNK、β-catenin和Wnt-5)孵育過(guò)夜；PBS洗滌3次后滴加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗，37 ℃振蕩孵育1 h。TBST 洗膜，辣根過(guò)氧化物酶ECL顯影，掃描記錄。利用Image J軟件對(duì)目的條帶進(jìn)行灰度值分析。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次取3個(gè)樣本。

1.4.3細(xì)胞增殖的CCK8檢測(cè) 將各組細(xì)胞分別接種于96孔板。待各組轉(zhuǎn)染24 h后，PBS液洗2次，2.5 g/L胰蛋白酶消化，制成單細(xì)胞懸液。調(diào)整細(xì)胞密度(3 000～ 6 000個(gè)細(xì)胞)，接種于96孔板中，重復(fù)6孔，置于培養(yǎng)箱，分別于培養(yǎng)24、48、72 和96 h時(shí)取出培養(yǎng)板，每孔加入10 μL的CCK8繼續(xù)培養(yǎng)2 h，于酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀450 nm波長(zhǎng)處讀取各孔光密度(OD)值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞活力曲線圖。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次取3個(gè)樣本。

1.4.4劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移 取轉(zhuǎn)染24 h 各組細(xì)胞，將細(xì)胞接種于6孔板中，細(xì)胞生長(zhǎng)完全融合后，用 10 μL槍頭在孔板中心軸處沿直線輕輕劃痕。培養(yǎng)24 h后在光學(xué)顯微鏡下觀察拍照，以細(xì)胞劃痕愈合百分比表示細(xì)胞遷移能力。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次取3個(gè)樣本。

1.4.5Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲 轉(zhuǎn)染后48 h消化收集各組細(xì)胞，使用含體積分?jǐn)?shù)0.01胎牛血清的DEME重懸細(xì)胞。取各組細(xì)胞懸液200 μL加入Transwell小室，下室加750 μL含體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清的DEME，置37 ℃孵箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后取出小室，用甲醇固定30 min，再以1 g/L甲紫染色20 min，棉簽輕輕擦去上層未遷移細(xì)胞。在400倍光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察細(xì)胞并計(jì)數(shù)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次取3個(gè)樣本。

1.4.6流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后96 h，用不含EDTA的胰蛋白酶消化；使用4 ℃預(yù)冷PBS洗滌，棄上清液，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞；移取100 μL細(xì)胞懸液于流式管內(nèi)，加入鈣離子依賴性磷脂結(jié)合蛋白和1 g/L碘化丙啶各5 μL；室溫避光反應(yīng)15 min；加入400 μL結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次取3個(gè)樣本。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 HDAC9基因沉默檢測(cè)

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與NC組細(xì)胞相比較，si-HDAC9組細(xì)胞的HDAC9mRNA(0.99±0.05 vs. 0.43±0.04)和蛋白(1.01±0.06 vs. 0.59±0.04)表達(dá)水平明顯下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=15.15、10.09，P<0.05)。

2.2 HDAC9基因沉默對(duì)Wnt信號(hào)通路影響

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA和蛋白表達(dá)結(jié)果表明，各基因mRNA和蛋白表達(dá)組間差異有顯著性(FmRNA=66.590～155.800，P均<0.05；F蛋白=83.110～159.400，P均<0.05)。Blank組和NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與NC組相比，pcDNA-HDAC9組各基因mRNA和蛋白表達(dá)水平均上升(tmRNA=5.125～15.990，P均<0.05；t蛋白=6.775～13.690，P均<0.05)；si-HDAC9組均明顯下降(tmRNA=3.966～13.930，P均<0.05；t蛋白=4.342～9.992，P均<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組各基因mRNA和蛋白表達(dá)水平水平逆轉(zhuǎn)，呈上升趨勢(shì)(tmRNA=15.390～16.800，P均<0.05；t蛋白=11.230～21.420，P均<0.05)。 見(jiàn)圖1。

2.3 HDAC9基因沉默對(duì)細(xì)胞增殖影響

CCK8檢測(cè)顯示，各組細(xì)胞增殖能力在0 h時(shí)無(wú)明顯差異(P>0.05)；在24～96 h細(xì)胞增殖能力組間差異有顯著性(F=9.070～66.850，P<0.05)。Blank組和NC組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與NC組相比，pcDNA-HDAC9組中細(xì)胞增殖速度在48～96 h均明顯加快(t=3.571～10.590，P均<0.05)；而si-HDAC9組在24～96 h顯著減慢(t=4.045～12.860，P均<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細(xì)胞增殖速度在24～96 h逆轉(zhuǎn)，呈上升趨勢(shì)(t=2.921～3.807，P均<0.05)。見(jiàn)圖2A。

2.4 HDAC9基因沉默對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲影響

劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲的研究結(jié)果顯示，細(xì)胞遷移和侵襲能力的組間差異有顯著意義(F=13.000、19.690，P均<0.05)。Blank組與NC組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)；與NC組相比，pcDNA-HDAC9組中細(xì)胞遷移和侵襲能力顯著增強(qiáng)(t=2.933、3.728，P均<0.05)；而si-HDAC9組顯著減弱(t=3.437、5.116，P均<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細(xì)胞遷移和侵襲能力逆轉(zhuǎn)，呈上升趨勢(shì)(t=3.984、4.032，P均<0.05)。見(jiàn)圖2B、C。

2.5 HDAC9基因沉默對(duì)細(xì)胞凋亡影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明，Blank組、NC組、pcDNA-HDAC9組、si-HDAC9組和si-HDAC9+rWnt3a組的細(xì)胞凋亡率分別為(28.75±1.77)%、(30.24±1.68)%、(20.61±1.40)%、(41.20±2.32)%和(24.52±1.42)%，細(xì)胞凋亡組間比較差異有顯著性(F=58.990，P<0.05)。Blank組與NC組細(xì)胞凋亡率差異無(wú)顯著性(P>0.05)；與NC組相比較，pcDNA-HDAC9組中細(xì)胞凋亡顯著降低(t=7.627，P<0.05)；而si-HDAC9組細(xì)胞凋亡顯著升高(t=6.627，P<0.05)；且與si-HDAC9組相比，si-HDAC9+rWnt3a組細(xì)胞凋亡逆轉(zhuǎn)，呈下降趨勢(shì)(t=10.620，P<0.05)。見(jiàn)圖3。

3 討 論

肺癌死亡率居世界第1位[12-13]。我國(guó)肺癌死亡率亦呈逐年上升趨勢(shì)[14-15]。肺癌預(yù)后極差。究其原因在于腫瘤轉(zhuǎn)移率和復(fù)發(fā)率高，腫瘤細(xì)胞具有免疫逃逸、自我更新及再生等干細(xì)胞特性[16-17]。

HDACs是一類轉(zhuǎn)錄抑制因子[18]，可分為四大類，HDAC9隸屬于Ⅱ型中的Ⅱa型，參與分化和發(fā)育過(guò)程[19]。其在多數(shù)腫瘤中呈高表達(dá)[20-21]。此外，經(jīng)典Wnt信號(hào)通路主要通過(guò)3種途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞行為并介導(dǎo)細(xì)胞間相互作用，如Wnt/β-catenin通路、Wnt/PcR通路以及Wnt/Ca2+途徑[22]，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用[23-25]。非小細(xì)胞肺癌中常伴隨Wnt信號(hào)通路的激活[26]。本研究之初推測(cè)，通過(guò)小分子干擾RNA、抗Wnt信號(hào)通路相關(guān)因子表達(dá)或其他方法，可抑制Wnt信號(hào)通路激活，抑制下游相關(guān)蛋白表達(dá)，阻斷非小細(xì)胞肺癌的發(fā)展。本文基于這一推論，驗(yàn)證HDAC9基因沉默介導(dǎo)Wnt信號(hào)通路對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的作用機(jī)制。

本文的研究結(jié)果顯示，HDAC9沉默序列能明顯降低HDAC9基因的mRNA和蛋白表達(dá)，從而沉默HDAC9基因。同時(shí)，pcDNA-HDAC9轉(zhuǎn)染細(xì)胞后HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5表達(dá)水平上升；而si-HDAC9轉(zhuǎn)染導(dǎo)致各因子表達(dá)水平下降。因此，相較于HDAC9表達(dá)上調(diào)對(duì)癌細(xì)胞Wnt信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)的影響，HDAC9沉默表達(dá)可抑制Wnt信號(hào)通路的激活。另外，本文同時(shí)設(shè)立si-HDAC9+rWnt3a組，旨在支持沉默HDAC9表達(dá)對(duì)Wnt信號(hào)通路的激活的抑制作用。rWnt3a為Wnt信號(hào)通路的激動(dòng)劑[27]，通過(guò)轉(zhuǎn)染si-HDAC9和rWnt3a，沉默HDAC9表達(dá)對(duì)JNK、β-catenin和Wnt-5表達(dá)的抑制作用逆轉(zhuǎn)，證實(shí)本文推測(cè)的合理性。同時(shí)，si-HDAC9轉(zhuǎn)染導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力明顯降低，凋亡增加；且si-HDAC9+rWnt3a轉(zhuǎn)染可逆轉(zhuǎn)si-HDAC9轉(zhuǎn)染后的上述趨勢(shì)。因此，HDAC9基因沉默可以抑制Wnt信號(hào)通路的激活，從而參與對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的調(diào)節(jié)。

A為qRT-PCR檢測(cè)各組mRNA表達(dá)；B為Western blot檢測(cè)各組蛋白表達(dá)；C為各蛋白電泳條帶圖。a：Blank組，b：NC組，c：pcDNA-HDAC9組，d：si-HDAC9組，e：si-HDAC9+rWnt3a組。與Blank組和NC組比較，*P<0.05；與si-HDAC9組比較，#P<0.05。

圖1 各組細(xì)胞中HDAC9、JNK、β-catenin、Wnt-5的mRNA及蛋白表達(dá)檢測(cè)

A為細(xì)胞增殖能力變化；B為細(xì)胞遷移數(shù)變化；C為細(xì)胞侵襲數(shù)變化。a：Blank組，b：NC組，c：pcDNA-HDAC9組，d：si-HDAC9組，e：si-HDAC9+rWnt3a組。與Blank組和NC組相比，*P<0.05；與si-HDAC9組相比，#P<0.05。

圖2 各組細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的檢測(cè)

總之，本研究證實(shí)HDAC9沉默表達(dá)可通過(guò)抑制Wnt信號(hào)通路激活，抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖、遷移與侵襲并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，為非小細(xì)胞肺癌的靶向治療提供了潛在分子靶點(diǎn)。Wnt信號(hào)通路是一個(gè)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)體系，且與其他信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)聯(lián)密切[28-29]。非小細(xì)胞肺癌中是否還存在Wnt信號(hào)通路與其他途徑的相互作用尚未明確；HDAC9沉默表達(dá)是否可作為特異性靶基因，并介導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞耐藥，均有待于未來(lái)進(jìn)一步探究。