動脈粥樣硬化病人血清APOC3檢測及其對TNF-α和JAM-1表達(dá)影響

(阜外華中心血管病醫(yī)院(河南省人民醫(yī)院)血管外科,河南 鄭州 450000)

心血管系統(tǒng)疾病的致死率在全部疾病中位居首位，心血管疾病嚴(yán)重危害著人類的生命健康[1]。動脈粥樣硬化是一種常見的發(fā)生于心血管系統(tǒng)的疾病，也是心血管疾病發(fā)生的征兆[2]。高血壓、高脂血癥、糖尿病、肥胖等均能夠引發(fā)動脈粥樣硬化[3]。冠心病是動脈粥樣硬化導(dǎo)致的較為典型的心血管疾病[4]。動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)。載脂蛋白C3(APOC3)廣泛存在于人體內(nèi)，在循環(huán)血漿中穩(wěn)定表達(dá)[5]。APOC3與冠心病、高血壓、糖尿病等疾病的發(fā)生密切相關(guān)[6]。血管內(nèi)皮細(xì)胞存在于血管的最內(nèi)層，在動脈粥樣硬化的發(fā)生過程中具有重要的作用，而APOC3是血管內(nèi)皮細(xì)胞功能的障礙因子[7]。目前，關(guān)于APOC3對血管內(nèi)皮細(xì)胞腫瘤壞死因子-α(TNF-α)與連接黏附分子-1(JAM-1)表達(dá)的影響還不明確。本研究分別收集了冠狀動脈有狹窄和無狹窄心臟病病人外周血清，檢測APOC3的表達(dá)水平，并以血管內(nèi)皮細(xì)胞為研究對象，探討APOC3對TNF-α與JAM-1表達(dá)影響，以期為進(jìn)一步研究動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2017年12月—2018年10月，選取在我院行手術(shù)或冠狀動脈造影檢測的心臟病病人80例，男性42例，女性38例，平均年齡48歲。其中有冠狀動脈狹窄者56例，無狹窄者24例。均符合文獻(xiàn)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。冠狀動脈狹窄病人與無狹窄者的年齡、性別等均匹配。本研究病人及家屬均知情同意，并經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞購自美國ATCC公司。APOC3、TNF-α試劑購自Prepro Tech公司；TNF-α、JAM-1、GAPDH單克隆抗體購自美國CTS公司；人APOC3 ELISA檢測試劑盒購自上海超研生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購自美國Thermo公司；倒置顯微鏡購自日本尼康公司。實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)試劑盒、cDNA合成試劑盒均購自天根生化科技(北京)有限公司；CFX 96Touch熒光定量PCR儀、GelDoc 2000凝膠成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1血清APOC3水平檢測 采集80例心臟病病人空腹12 h后的外周靜脈血3 mL。血液凝固后分離出血清。采用ELISA法檢測血清中APOC3含量。按照試劑盒說明書操作。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng) 取出保存于液氮罐中的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，置37 ℃培養(yǎng)箱中融化后，加入含有體積分?jǐn)?shù)0.10胎牛血清(FBS)的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，混勻后以1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用5 mL細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h后，觀察細(xì)胞約為90%融合時(shí)，棄掉細(xì)胞懸浮液，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入2.5 g/L胰蛋白酶消化細(xì)胞，離心后用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.3qRT-PCR檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-α、JAM-1 mRNA表達(dá) 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，加入胰蛋白酶消化細(xì)胞后，再加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，調(diào)整細(xì)胞密度使每孔中加入的細(xì)胞數(shù)為4×105個(gè)。置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，棄上清液。在細(xì)胞中分別加入終濃度為0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，用PBS洗滌細(xì)胞2次。加入Trizol細(xì)胞裂解液，提取細(xì)胞RNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書分別檢測TNF-α、JAM-1 mRNA水平。所用引物及其序列見表1。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

表1 qRT-PCR引物及其序列

1.3.4Western blot檢測人血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α、JAM-1蛋白表達(dá) 人血管內(nèi)皮細(xì)胞分別經(jīng)0、15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，放置于冰上裂解30 min。4 ℃下12 000 r/min離心15 min，取蛋白上清至新EP管中，用BCA蛋白濃度檢測試劑盒檢測提取的蛋白濃度。蛋白樣品與Loading buffer煮沸變性后，加入到SDS-PAGE凝膠孔中，每孔中加入變性蛋白樣品50 μL，以初始電壓為80 V電泳30 min后，調(diào)整電壓為120 V至電泳結(jié)束。取出蛋白凝膠在4 ℃下轉(zhuǎn)印至PVDF膜上。經(jīng)50 g/L脫脂奶粉封閉后，依次與一抗(1∶500)、二抗(1∶1 000)反應(yīng)后，轉(zhuǎn)移至暗室中滴加顯色液，曝光后以GAPDH為內(nèi)參，分析蛋白表達(dá)率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.3.5TNF-α對人血管內(nèi)皮細(xì)胞JAM-1mRNA和蛋白表達(dá)影響 取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的人血管內(nèi)皮細(xì)胞，棄細(xì)胞培養(yǎng)液，用胰蛋白酶消化后，接種到12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置37 ℃、體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，將細(xì)胞培養(yǎng)液換成含有終濃度為0、1.0 mg/L的TNF-α細(xì)胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)16 h后收集細(xì)胞。采用qRT-PCR、Western blot檢測細(xì)胞中JAM-1mRNA和蛋白表達(dá)水平。步驟同1.3.3和1.3.4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每次3個(gè)復(fù)孔。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 病人血清中APOC3含量檢測

結(jié)果表明，56例冠狀動脈有狹窄病人血清APOC3為(9.36±0.95)g/L，明顯高于24例無狹窄病人的(7.42±0.74)g/L，差異有顯著性(t=2.790,P<0.01)。

2.2 APOC3對血管內(nèi)皮細(xì)胞JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)影響

采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1mRNA和蛋白水平均高于0 mg/L者；血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1mRNA和蛋白水平隨著15、30、60 mg/L 的APOC3作用濃度的增加而增加(F=69.633、178.421，t=9.137～17.473，P<0.01)。而120 mg/L的APOC3作用后，細(xì)胞中JAM-1mRNA和蛋白水平較60 mg/L者有所下降。見表2。

2.3 APOC3對血管內(nèi)皮細(xì)胞TNF-α mRNA和蛋白表達(dá)影響

采用15、30、60、120 mg/L的APOC3作用16 h后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中TNF-αmRNA和蛋白均明顯高于0 mg/L者(F=28.746、50.426，P<0.01)。TNF-αmRNA和蛋白水平?jīng)]有隨著APOC3作用濃度的升高而增加。見表2。

APOC3濃度(ρ/mg·L-1)JAM-1mRNA蛋白TNF-αmRNA蛋白 01.00 0.03±0.01 1.00 0.10±0.02 152.66±0.26*0.11±0.01*2.49±0.18*0.47±0.04*303.70±0.31*0.21±0.02*2.46±0.31*0.49±0.03*604.53±0.33*0.43±0.03*2.58±0.29*0.46±0.06*1203.13±0.32*0.22±0.02*2.50±0.16*0.45±0.04*

注：不同濃度之間比較，F(xiàn)=28.746～178.421，P<0.001；與0 mg/L比較，*t=9.137～21.909，P<0.01。

2.4 TNF-α對血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1 mRNA和蛋白表達(dá)影響

采用1.0 μg/L的TNF-α作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1mRNA和蛋白水平均明顯高于0 μg/L者，差異有顯著性(t=8.167、15.589，P<0.01)。見表3。

TNF-α濃度(ρ/μg·L-1)JAM-1 mRNAJAM-1蛋白0 1.00 0.17±0.021.02.35±0.15* 0.34±0.03*

與0 μg/L 濃度比較，*t=8.167、15.589，P<0.01。

3 討 論

動脈粥樣硬化是一種常見的動脈硬化血管疾病。動脈粥樣硬化形成與復(fù)合糖類和脂質(zhì)的聚集、血栓的形成、纖維組織增生的出現(xiàn)、動脈中層的鈣化等有關(guān)。當(dāng)病變逐漸累積到阻塞動脈腔時(shí)，由該動脈供應(yīng)的組織器官出現(xiàn)缺血甚至壞死[9]。動脈粥樣硬化血管彈性減弱，管壁上出現(xiàn)類似于米粒樣的脂類[10-11]。另外，動脈粥樣硬化會導(dǎo)致動脈腔變窄，進(jìn)而引發(fā)高血壓心臟病的發(fā)生。

載脂蛋白是指血漿脂蛋白中的蛋白成分，可以分為A、B、C、D、E等5類[11]。載脂蛋白是脂類物質(zhì)的運(yùn)輸載體，其中部分載脂蛋白還具有脂蛋白代謝酶激活、受體的識別等作用[12]。載脂蛋白C具有水溶性，能夠調(diào)控肝脂酶和脂蛋白脂酶的活性[13]。APOC3基因全長為3.1 kb，位于第11號染色體上[14]。臨床研究結(jié)果表明，APOC3能夠引起冠心病的發(fā)生，與高血壓、高脂血癥、肥胖等均有密切關(guān)系[15]。過表達(dá)APOC3小鼠的高三酰甘油血癥明顯加重，經(jīng)過飼喂高脂飼料后，小鼠出現(xiàn)脂肪肝變性和明顯的胰島素抵抗[16]。已有研究結(jié)果顯示，冠狀動脈狹窄病人血清總APOC3濃度明顯升高[17]。本文研究結(jié)果也顯示，APOC3在冠狀動脈狹窄病人血清中的表達(dá)明顯增高。

免疫炎癥是目前研究較多的動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制。脂質(zhì)的積累和炎癥的共同長期作用導(dǎo)致動脈粥樣硬化的發(fā)生[18]。APOC3、TNF-α、JAM-1等均與動脈粥樣硬化的發(fā)生有關(guān)[19]。有研究結(jié)果表明，JAM-1在動脈粥樣硬化斑塊組織中的表達(dá)增高[20]。TNF-α是一種具有多重作用的細(xì)胞因子，具有調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮功能的作用，與動脈粥樣硬化的形成密切相關(guān)[21]。本研究用不同濃度的APOC3作用血管內(nèi)皮細(xì)胞，觀察TNF-α、JAM-1mRNA和蛋白表達(dá)的變化。本文結(jié)果表明，TNF-α、JAM-1mRNA和蛋白表達(dá)均上調(diào)。其中JAM-1mRNA和蛋白表達(dá)水平在一定濃度范圍內(nèi)呈現(xiàn)濃度依賴，而TNF-αmRNA和蛋白表達(dá)水平并沒有出現(xiàn)濃度依賴。采用TNF-α作用后，血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1mRNA和蛋白表達(dá)升高，提示APOC3可能通過誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1的表達(dá)。

綜上所述，APOC3在動脈粥樣硬化病人血清中表達(dá)上調(diào)。APOC3可能通過誘導(dǎo)TNF-α表達(dá)進(jìn)而促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞中JAM-1的表達(dá)，APOC3可能是炎癥、細(xì)胞黏附的連接分子，有望成為預(yù)防和治療動脈粥樣硬化的靶點(diǎn)。本研究為進(jìn)一步探討動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為治療動脈粥樣硬化提供了新思路。由于動脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜，對APOC3在動脈粥樣硬化中的具體作用機(jī)制，有待于進(jìn)一步研究。