白藜蘆醇對肌萎縮側(cè)索硬化癥轉(zhuǎn)基因小鼠的療效及機(jī)制

王鳳 陳星宇

(廈門大學(xué)附屬中山醫(yī)院，福建 廈門 361000)

肌萎縮側(cè)索硬化癥(ALS)是一種累及脊髓、腦干和皮質(zhì)運(yùn)動神經(jīng)元的神經(jīng)變性疾病〔1〕。臨床表現(xiàn)為進(jìn)行性加重的無力、四肢及軀干肌肉萎縮，導(dǎo)致運(yùn)動功能障礙甚至呼吸肌麻痹，患者多于3～5年內(nèi)死亡〔2〕。世界流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示，美國有12 000～15 000例ALS，中國約有20萬例ALS〔3,4〕。ALS的發(fā)病原因復(fù)雜，給患者帶來“毀滅性”的影響。放射性損傷、環(huán)境因素、重金屬中毒、腫瘤、自體免疫等都可能成為患病因素。ALS涉及多種發(fā)病機(jī)制，目前主要包括氨基酸的興奮性毒性作用、遺傳假說、氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙、神經(jīng)營養(yǎng)因子障礙、自身免疫機(jī)制、病毒感染、神經(jīng)炎癥、蛋白清除障礙及軸突運(yùn)動障礙等發(fā)病假說〔5,6〕。目前沒有能給ALS患者帶來實(shí)質(zhì)性臨床獲益的治療方案，國際承認(rèn)、且唯一通過美國食品藥物監(jiān)督局批準(zhǔn)治療ALS的藥物為Covis Pharma的谷氨酸釋放抑制劑利魯唑〔7〕和田邊三菱公司的自由基清除劑依達(dá)拉奉〔8〕，但以上藥物只能改善患者的生存質(zhì)量，不能阻止ALS的發(fā)病進(jìn)程。利魯唑雖然能輕微改善部分患者的功能和生存率，但是其價(jià)格昂貴整體受益較差；依達(dá)拉奉長期用藥出現(xiàn)的毒副作用也限制了它的應(yīng)用。針對ALS的藥物開發(fā)情況不容樂觀，我國尚缺乏自主研發(fā)的ALS治療藥物。白藜蘆醇(Res)是多酚類化合物，已被證實(shí)可激活沉默信息調(diào)節(jié)因子2相關(guān)酶(SIRT)1且廣泛用于各種實(shí)驗(yàn)中，是一種研究較多的SIRT1激動劑，它主要來源于蓼科植物的根莖中。Res具有抗炎、抗癌、抗氧化、抗心血管疾病等廣泛有益作用。鑒于其抗氧化能力有神經(jīng)保護(hù)的作用，近年來Res逐漸被應(yīng)用于神經(jīng)退行性疾病治療研究〔9～11〕。本實(shí)驗(yàn)采用B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉(zhuǎn)基因ALS小鼠為研究對象，觀察Res對ALS小鼠的療效，并對其機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物與分組給藥 12周齡的雄性轉(zhuǎn)基因雜合子小鼠 B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J(Stock No.002726)，平均體重(30±2)g；同窩野生型B6SJL小鼠(WT組)，平均體重(30±2)g，購于美國Jackson實(shí)驗(yàn)室(Bar Harbor,ME USA 04609)。所有小鼠按照廣州中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動物飼養(yǎng)管理規(guī)程進(jìn)行飼養(yǎng)〔實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK (粵)2013-0001〕。房間溫度維持(23±3)℃，濕度為40%～70%，房間保持12 h晝夜節(jié)律，小鼠自由進(jìn)食和飲水。實(shí)驗(yàn)中所有操作遵循美國國立衛(wèi)生研究院(NIH)及廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會的相關(guān)規(guī)定。40只12周齡雄性B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠被隨機(jī)分配到SOD1-G93A組、Res組(7.5 mg/kg、15.0 mg/kg、30.0 mg/kg)和利魯唑組(5 mg/kg)，每組8只。同窩出生的小鼠作為野生組(WT 組)。Res組每天灌胃給藥對應(yīng)濃度的Res 2次；利魯唑組每天灌胃給藥利魯唑2次；WT 組和SOD1-G93A 組每天灌胃給藥同等劑量的生理鹽水2次。給藥3個月后采用爬桿實(shí)驗(yàn)、轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)、抓力實(shí)驗(yàn)和曠場實(shí)驗(yàn)等行為學(xué)實(shí)驗(yàn)評價(jià)各組肌肉力量及運(yùn)動癥狀的改善效果。

1.2主要實(shí)驗(yàn)試劑 丁基苯酞原料藥購買于Sigma公司，陽性對照藥利魯唑片購買于萬特制藥(海南)有限公司，3-硝基酪氨酸(NT)和8-羥基脫氧鳥苷(OHdG)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(Abcam公司)，丙二醛(MDA)試劑盒(南京建成生物有限公司)，核因子NF-E(Nrf)2和血紅素氧合酶(HO)1抗體(Santa Cruz公司)，Trizol(Invitrogen)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas，K1622)，GT VisionTM Ⅲ抗鼠/兔通用型免疫組化檢測試劑盒〔基因科技(上海)有限公司〕。其余試劑均購于Sigma公司。

1.3主要實(shí)驗(yàn)儀器 動物稱量天平〔梅特勒-特利多儀器(上海)有限公司〕，倒置顯微鏡(Olympus IX71，日本)，石蠟切片機(jī)和石蠟包埋機(jī)(Leica，德國)，多功能酶標(biāo)儀(BioTEK，美國)，自制爬桿裝置(長55 cm，直徑1 cm)，開放場裝置(PanLab，西班牙)，轉(zhuǎn)棒裝置(安徽正華儀器有限公司)，YLS-13A大小鼠抓力測定儀(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)，半干式轉(zhuǎn)膜儀和電泳裝置(BioRad，美國)，實(shí)時定量PCR儀(Thermo，美國)。

1.4方法

1.4.1行為學(xué)指標(biāo)測定〔12〕爬竿實(shí)驗(yàn)：采用自制長55 cm，直徑1 cm，頂端放置一個直徑3 cm小球，外表面纏繞2層紗布的爬桿裝置。垂直放置在小鼠籠中，將小鼠頭部朝下置于桿的頂部球上,讓其沿桿自然爬下,記錄小鼠前肢碰到桿底所需要的時間，測定時限120 s，小鼠不能持桿、完全自然下滑者或不能調(diào)頭者，記錄其爬桿時間為120 s，每只小鼠測量3次，每次間隔30 min。

曠場實(shí)驗(yàn)：握住小鼠尾部1/3處輕放于曠場裝置(長×寬×高=50 cm × 50 cm × 40 cm)的正中央，使小鼠適應(yīng)5 min后，利用自主攝影系統(tǒng)記錄小鼠的自發(fā)活動，連續(xù)記錄10 min，并用相關(guān)軟件分析處理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)小鼠整個自主運(yùn)動的總距離。鑒于動物的生活習(xí)性，實(shí)驗(yàn)均在9∶00～12∶00 AM進(jìn)行，每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束用70%的酒精擦拭曠場。

轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)：YSL-4C小鼠轉(zhuǎn)棒式疲勞儀設(shè)定起始轉(zhuǎn)速為5 r/min，轉(zhuǎn)速保持20 s后，依次增加5 r/min并保持20 s，最后加速到30 r/min，檢測時間共計(jì)3 min。手持小鼠尾部置于正在運(yùn)轉(zhuǎn)的轉(zhuǎn)棒儀上，并開始計(jì)時，記錄小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上停留的時間(即第一次掉落的時間)，每只小鼠測定3次，每次間隔1 h。數(shù)據(jù)用以評價(jià)小鼠四肢協(xié)調(diào)性和平衡性。

抓力實(shí)驗(yàn)：YLS-13A小鼠抓力測定儀水平放置，使抓力板呈現(xiàn)水平運(yùn)動，測量記錄小鼠后肢抓力值，每只小鼠測定3次，每次間隔30 min，取平均值作為統(tǒng)計(jì)以評價(jià)藥物對動物肢體力量影響程度。

1.4.2標(biāo)本采集及相關(guān)指標(biāo)測定 利用微量管牽拉儀牽拉玻璃毛細(xì)管(內(nèi)徑為0.75 mm，外徑為1.0 mm)，在解剖顯微鏡下用鑷子打破尖銳毛細(xì)管的尖端，使破碎尖端的內(nèi)徑為10～20 μm，將細(xì)管和注射器連接到毛細(xì)管支架的另一端，并用三通閥連接細(xì)管和注射器。小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪〔(8.7+1.3)mg/100 g〕深度麻醉后，使用小鼠適配器固定小鼠頭部(頭后部朝上，鼻子指向約45°，使用剪刀和彎曲的鑷子，切開皮膚和分離第一層肌肉直到頭骨基部只露出一層薄薄的肌肉，并將這些肌肉層移到側(cè)面暴露硬腦膜(三角形狀，通常有1～2條大血管穿過該區(qū)域；或者血管的一側(cè))，清潔后用干燥的棉花擦干該區(qū)域，抽取小鼠腦脊液；用1 ml注射器插入心臟抽取血液，放于1.5 ml離心管中，室溫靜置30 min后，3 000 r/min離心10 min，吸取上清，分裝于-80℃保存?zhèn)溆?。待所有?biāo)本采集完畢后，嚴(yán)格按照8-OHdG、3-NT和MDA檢測試劑盒相關(guān)說明對標(biāo)本進(jìn)行檢測。

1.4.3免疫染色運(yùn)動神經(jīng)元〔12〕小鼠用氯胺酮和甲苯噻嗪〔(8.7+1.3)mg/100 g〕深度麻醉后，心臟灌注沖洗至流出的液體為無色，切取小鼠腰4～5段后迅速浸泡于4%多聚甲醛溶液中，隨后用梯度乙醇脫水，二甲苯透明后透蠟，包埋后連續(xù)切片脊髓為5 μm，進(jìn)行后續(xù)染色。切片在65℃烤箱脫蠟1 h，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇溶液脫蠟復(fù)水后，放于0.05 mol/L檸檬酸緩沖液(pH=6.0)中加熱煮沸，抗原修復(fù)10 min，自然冷卻后，放入3%H2O2溶液中避光反應(yīng)10 min，去除內(nèi)源性的過氧化物酶，10%胎牛血清封閉1 h后滴加Neuro N一抗(1∶200)4℃孵育過夜，PBS洗滌3次后，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1∶200)，室溫孵育1 h；二氨基苯胺(DAB)工作液顯色，自來水終止顯色反應(yīng)，梯度酒精脫水和二甲苯透明后用中性樹脂封片，最后，倒置熒光顯微鏡下拍照小鼠脊髓組織Neuro N染色陽性的運(yùn)動神經(jīng)元。

1.4.4Western印跡檢測〔13〕分離的各組小鼠脊髓組織，按照V/W(10 μl∶1 mg)加入含1 μg/ml PMSF和1 μl磷酸化酶抑制劑的RIPA緩沖液，冰上勻漿3 min后，4℃條件下12 000 r/min離心15 min，取上清，用Pierce BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。上樣30 μg蛋白，調(diào)節(jié)電壓至80 V，待溴酚蘭剛跑出分離膠底部即可終止電泳，然后將PAGE凝膠放于半干轉(zhuǎn)印槽，恒壓15 V條件下轉(zhuǎn)膜2 h，5%奶粉的封閉2 h，TBST緩沖液洗3次，每次5 min，加入抗體稀釋液稀釋至適當(dāng)濃度的一抗(1∶1 000)，4℃條件下孵育過夜。TBST清洗后加入HRP標(biāo)記的二抗(HRP-IgG，1∶2 000)，室溫孵育2 h，TBST洗滌后，加入ECL顯影液，在發(fā)光成像系統(tǒng)曝光顯影并利用該凝膠圖象處理系統(tǒng)分析其灰度值。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism5軟件進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1Res對SOD1-G93A小鼠體重的影響 給藥前和給藥后每隔1個月稱量小鼠體重，計(jì)算各組給藥后相比給藥前的體重變化率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，給藥3個月后SOD1-G93A組體重并未明顯變化，而WT組體重明顯增加，兩者比較差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。利魯唑組相對SOD1-G93A組體重?zé)o明顯變化，而給藥劑量30 mg/kg 的Res組體重與SOD1-G93A組比較差異均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

表1 各組給藥后1～3個月體重變化率

與同時間點(diǎn)SOD1-G93A組比較：1)P<0.001；與同組給藥2個月比較：2)P<0.001；與同組給藥1個月比較：3)P<0.001；與同組給藥時比較：4)P<0.001

2.2Res顯著改善SOD1-G93A小鼠的運(yùn)動行為學(xué)癥狀 SOD1-G93A小鼠肌肉萎縮無力，表現(xiàn)出明顯的行為學(xué)障礙。在爬桿實(shí)驗(yàn)中，SOD1-G93As小鼠的爬桿時間顯著高于WT組(P<0.001)。Res給藥治療3個月后(除Res組7.5 mg/kg外)，小鼠的運(yùn)動行為學(xué)障礙得到顯著改善，爬桿時間與SOD1-G93A組相比顯著降低，30.0 mg/kg Res組爬桿時間與利魯唑組相當(dāng)。在轉(zhuǎn)棒實(shí)驗(yàn)中，WT組平均潛伏期SOD1-G93A組相比差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，7.5、15.0和30.0 mg/kg Res治療后顯著增加小鼠在轉(zhuǎn)棒儀上的時間。在曠場實(shí)驗(yàn)中，與WT組相比，SOD1-G93A組運(yùn)動距離明顯下降(P<0.001)，不同給藥劑量的Res組可以顯著提高運(yùn)動距離(P<0.05)。在抓力實(shí)驗(yàn)中，與WT組相比，SOD1-G93A組抓力顯著下降(P<0.001)，15.0、30.0 mg/kg Res治療后顯著增加小鼠的后肢抓力(P<0.001)。見表2。

表2 各組給藥后運(yùn)動行為比較

與WT組比較：1)P<0.001；與SOD1-G93A組比較：2)P<0.01；3)P<0.001；下表同

2.3Res顯著降低SOD1-G93A小鼠血清和腦脊液中3-NT和8-OHdG的含量 在血清和腦脊液標(biāo)本中，與WT組相比，SOD1-G93A組3-NT和8-OHdG的含量明顯上升(P<0.001)，15.0、30.0 mg/kg Res組可顯著降低3-NT和8-OHdG的含量(P<0.001)。見表3。

表3 各組血清和腦脊液中8-OHdG和3-NT含量比較

2.4Res顯著降低SOD1-G93A小鼠血清和腦脊液中MDA的含量 在血清和腦脊液中，與WT組相比，SOD1-G93A組MDA含量明顯上升(P<0.001)，15.0、30.0 mg/kg Res治療后可顯著降低SOD1-G93A小鼠血清和腦脊液中MDA的含量，并且效果優(yōu)于利魯唑組。見表4。

2.5Res顯著增加小鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)量 WT組、SOD-G93A組、7.5、15.0、30.0 mg/kg Res組和利魯唑組平均運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目分別為(19.1±0.67)、(8.4±1.01)、(10.0±0.98)、(13.4±1.05)、(16.4±0.76)和(14.9±1.06)個。與WT組相比，SOD1-G93A組脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元明顯減少(P<0.001)，病變的神經(jīng)元逐漸出現(xiàn)核固縮，細(xì)胞邊界模糊不清和細(xì)胞體積減小。與SOD1-G93A組相比，15.0、30.0 mg/kg Res組脊髓前角的運(yùn)動神經(jīng)元顯著增多，胞體增大，未見明顯細(xì)胞核固縮現(xiàn)象。見圖1。

表4 各組血清和腦脊液中MDA含量比較

圖1 各組小鼠脊髓組織Neuro N陽性運(yùn)動神經(jīng)元免疫組化檢測(DAB，×50)

2.6Res顯著增加SOD1-G93A小鼠脊髓組織Nrf2和HO-1蛋白的表達(dá) 與WT組相比，SOD1-G93A小鼠脊髓組織Nrf2和HO-1的蛋白含量顯著降低(P<0.001)，7.5、15.0、30.0 mg/kg Res組可顯著增加Nrf2和HO-1的蛋白表達(dá)(P<0.01)。見圖2、表5。

1～6：WT組、SOD1-G93A組、7.5 mg/kg Res組、15.0 mg/kg Res組、30.0 mg/kg Res組、利魯唑組圖2 各組脊髓組織中Nrf2和HO-1的蛋白水平

表5 各組Nrf2和HO-1蛋白相對灰度值

3 討 論

B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠是目前研究ALS較為流行的動物模型之一。其運(yùn)動癥狀開始于后肢，以雙后肢肌力減退和癱瘓為主，并逐漸發(fā)展累及軀干和前肢。B6SJL-Tg(SOD1-G93A)1Gur/J轉(zhuǎn)基因小鼠的主要病理學(xué)特征是腰段脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目丟失，小鼠肌肉萎縮無力，出現(xiàn)明顯的運(yùn)動行為學(xué)障礙，ALS小鼠出現(xiàn)運(yùn)動功能障礙時運(yùn)動神經(jīng)元的數(shù)目丟失可達(dá)44%以上。因此脊髓前腳運(yùn)動神經(jīng)元數(shù)目和運(yùn)動功能是ALS轉(zhuǎn)基因小鼠疾病進(jìn)展最可靠和最客觀的評價(jià)指標(biāo)〔14〕。本研究結(jié)果表明Res在一定程度上延緩了運(yùn)動神經(jīng)元的丟失，改善了ALS小鼠的運(yùn)動障礙，對SOD1 G93A轉(zhuǎn)基因小鼠脊髓前角運(yùn)動神經(jīng)元具有顯著的保護(hù)作用。氧化應(yīng)激產(chǎn)生的活性氧可直接或間接地?fù)p傷細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等大分子物質(zhì)的生理功能，是包括ALS疾病在內(nèi)發(fā)生的病理生理基礎(chǔ)。8-OHdG是活性氧自由基如羥自由基、單線態(tài)氧等攻擊DNA分子中的鳥嘌呤堿基第8位碳原子而產(chǎn)生的一種氧化性加和物，是DNA氧化損傷最常用的生物標(biāo)志物之一〔15〕；3-NT是蛋白質(zhì)氧化損傷的標(biāo)記物〔16〕；MDA是生物膜中的多不飽和脂肪酸脂質(zhì)過氧化作用產(chǎn)物。本研究結(jié)果說明，Res抵抗氧化損傷保護(hù)脊髓運(yùn)動神經(jīng)元。機(jī)體細(xì)胞本身具有一套復(fù)雜的抗氧化系統(tǒng)，該系統(tǒng)組成Nrf2-抗氧化反應(yīng)元件(ARE)-抗氧化酶通路，Nrf2是細(xì)胞氧化應(yīng)激的重要因子，其通過與ARE相互作用調(diào)節(jié)編碼抗氧化蛋白，是機(jī)體內(nèi)源性抗氧化應(yīng)激的重要通路〔17〕。本研究結(jié)果說明，Res可通過激活Nrf2-HO 1抗氧化應(yīng)激通路抵抗自由基對組織的氧化損傷，從而降低8-OHdG、3-NT和MDA的含量。Res在阿爾茨海默病、帕金森病等多種神經(jīng)退行性疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用，其保護(hù)作用是通過抑制自由基產(chǎn)生、神經(jīng)細(xì)胞凋亡及改善線粒體功能等實(shí)現(xiàn)。Res極有可能成為新的以神經(jīng)元保護(hù)為特點(diǎn)的抗 ALS藥物，因此其在臨床治療ALS及其他神經(jīng)變性疾病中的意義有必要深入研究。