SD大鼠心臟結(jié)構(gòu)和功能增齡性改變及與炎癥因子表達(dá)的相關(guān)性

劉海娘 付浩燃 于勤

(1大連大學(xué),遼寧 大連 116001；2大連大學(xué)附屬中山醫(yī)院循環(huán)三科)

自然衰老與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展有密切聯(lián)系。臨床研究顯示增齡本身是心臟結(jié)構(gòu)改變、功能減退的獨(dú)立危險(xiǎn)因素〔1〕。心力衰竭(簡(jiǎn)稱心衰)是近年來(lái)臨床常見(jiàn)的心血管疾病，主要的病理改變是心肌細(xì)胞的肥大和間質(zhì)的纖維化，臨床表現(xiàn)為心臟功能不全〔2,3〕。流行病學(xué)資料顯示〔4,5〕，心衰主要發(fā)生于高血壓、心臟結(jié)構(gòu)和功能異常的老年患者，且隨著年齡的增加，心衰的發(fā)病人數(shù)在不斷增加。心血管疾病，尤其是心衰初始的發(fā)生發(fā)展往往和心肌炎密切相關(guān)，炎癥因子的大量表達(dá)會(huì)加劇心臟結(jié)構(gòu)的病理改變〔6～8〕。目前，關(guān)于心臟結(jié)構(gòu)和功能隨著年齡的增加如何改變，其改變與炎癥因子表達(dá)的關(guān)系如何未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究將探究SD大鼠隨著月齡的增加，其心臟結(jié)構(gòu)和功能的改變，同時(shí)分析其與炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF)-α表達(dá)的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1試劑材料 TNF-α酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒購(gòu)自美國(guó)博士德生物工程有限公司，兔抗鼠多克隆TNF-α抗體購(gòu)自中國(guó)萬(wàn)類科技生物有限公司和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)研究所，Masson試劑購(gòu)自安特捷生物有限公司。

1.2動(dòng)物及分組 清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重350～550 g，購(gòu)于大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)2 w，予正常飲食飲水。30只大鼠根據(jù)月齡分為3 組：6月齡組、18月齡組和26月齡組，每組10只。整個(gè)實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)過(guò)大連大學(xué)倫理委員會(huì)討論通過(guò)。

1.3超聲心動(dòng)圖測(cè)定心臟大小和心功能 采用10%水合氯醛按3 ml/kg腹腔注射麻醉大鼠。大鼠麻醉生效后，以5%硫化鈉進(jìn)行脫毛處理，取仰臥位，采用GE Vivid E9彩色多普勒超聲診斷儀，12.0 MHz的高頻探頭，行心功能參數(shù)測(cè)量。選擇M型超聲經(jīng)胸骨左緣左室長(zhǎng)軸切面測(cè)量左室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)、左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)，同時(shí)儀器系統(tǒng)自動(dòng)計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)和左室短軸縮短率(LVFS)值。其中LVFS=(LVEDD-LVESD)/LVEDD×100%，LVEF則按照Teichholz公式〔9〕。采用彩色多普勒超聲于心尖四腔切面取二尖瓣口正向血流頻譜，測(cè)量二尖瓣舒張?jiān)缙谘魉俣确逯?E)和二尖瓣舒張晚期血流速度峰值(A)；組織多普勒超聲于心尖四腔切面取二尖瓣環(huán)頻譜，測(cè)量二尖瓣環(huán)舒張?jiān)缙谶\(yùn)動(dòng)速度峰值(E′)，并計(jì)算E/A和E/E′。上述心臟超聲參數(shù)的獲取均由專業(yè)的超聲醫(yī)生完成操作，每只大鼠測(cè)量3個(gè)心動(dòng)周期，取平均值。

1.4血清TNF-α的測(cè)定 超聲完成后，從大鼠的腹主動(dòng)脈抽出血液約2 ml放入4℃冰箱中靜置過(guò)夜，3 000 r/min 離心10 min 分離血清，吸取上清液保存于EP管。根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定各組大鼠血清中TNF-α含量。

1.5免疫組化測(cè)定心肌組織中TNF-α含量 處死大鼠后開(kāi)胸取出心臟，取左室心肌組織行常規(guī)石蠟包埋和組織切片，片厚4 μm，行免疫組化檢測(cè)心肌組織TNF-α的表達(dá)。顯微鏡下觀察免疫組化染色切片，TNF-α陽(yáng)性表達(dá)顯示為棕黃色。左室心肌組織TNF-α含量的評(píng)價(jià)：每組動(dòng)物取5張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野，用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件分析，計(jì)算出TNF-α陽(yáng)性表達(dá)百分比，即棕黃色陽(yáng)性表達(dá)面積占整個(gè)心肌組織面積的百分比，取測(cè)量的平均值比較。

1.6Masson 染色檢測(cè)膠原的含量 同1.5中組織切片后，行Masson 三色染色法觀察心肌纖維化的程度。顯微鏡下觀察Masson 染色切片，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色。左室心肌間質(zhì)纖維沉積的評(píng)價(jià)：每組動(dòng)物取5張切片，每張切片取5個(gè)高倍視野，用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件分析，計(jì)算出膠原容積分?jǐn)?shù)(CVF)，即膠原纖維面積占整個(gè)心肌組織面積的百分比，取測(cè)量的平均值比較。

1.7心肌超微結(jié)構(gòu)的觀察 麻醉后立即開(kāi)胸取出心臟，迅速取左心室前壁心肌，切成1 mm ×1 mm ×1 mm 的小塊狀，立即浸入2.5 %的戊二醛復(fù)方固定液中，標(biāo)本送檢于大連醫(yī)科大學(xué)電鏡實(shí)驗(yàn)中心，使用透射電子顯微鏡(JEM-2000EX,JEOL,Japan)觀察不同組別心肌組織的超微結(jié)構(gòu)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，同時(shí)采用雙變量Pearson分析進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié) 果

2.1心臟結(jié)構(gòu) 與6月齡大鼠比較，18月齡和26月齡大鼠LVESD、LVEDD逐漸增大，IVSD逐漸增厚，8月齡LVEDD、IVSD與6月齡組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，26月齡LVEDSD、LVEDD、IVSD與6月齡大鼠比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，26月齡LVEDD與18月齡比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。隨著年齡的增加LVEF、LVFS逐漸降低，與6月齡和18月齡大鼠相比，26月齡大鼠LVEF、LVFS顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。 見(jiàn)表1和圖1。

表1 不同月齡大鼠M型超聲參數(shù)變化

與6月齡組比較:1)P<0.05;與18月齡組比較:2)P<0.05，下表同

圖1 不同月齡大鼠心臟結(jié)構(gòu)變化 M型超聲

2.2心臟功能 與6月齡大鼠比較，18月齡和26月齡大鼠心臟舒張功能逐漸變差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同月齡大鼠心臟多普勒參數(shù)變化

2.3左室心肌組織Masson染色 6月齡大鼠心肌組織基本無(wú)膠原增生，其心肌組織CVF為(1.39±0.19)%；18月齡大鼠心肌組織中膠原纖維與6月齡組比較明顯增生(P<0.05)，其心肌組織CVF為(3.03±0.63)%；26月齡大鼠〔心肌組織CVF為(7.92±0.47)%〕與18月齡及6月齡相比心肌組織中膠原纖維均有顯著增生，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

圖2 不同月齡大鼠左室心肌組織(Masson染色，×200)

2.4各組大鼠左室心肌組織超微結(jié)構(gòu) 6月齡大鼠的心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，肌原纖維排列整齊，肌節(jié)完整，Z 線結(jié)構(gòu)清晰，線粒體嵴結(jié)構(gòu)清晰；18月齡大鼠心肌細(xì)胞略有腫脹，肌原纖維結(jié)構(gòu)排列基本整齊，Z線結(jié)構(gòu)較清晰，線粒體略有增生，嵴較清晰，心肌細(xì)胞間可見(jiàn)膠原纖維輕度增生；26月齡大鼠心肌細(xì)胞腫脹，肌原纖維結(jié)構(gòu)松散，部分肌原纖維斷裂、溶解，排列紊亂，部分Z線消失，線粒體嵴減少，結(jié)構(gòu)不清晰，心肌細(xì)胞間可見(jiàn)大量膠原纖維。見(jiàn)圖3。

圖3 不同月齡大鼠左室心肌組織超微結(jié)構(gòu)(× 1 500)

2.5各組大鼠心肌組織和血清中TNF-α含量 6月齡大鼠心肌組織和血清中TNF-α表達(dá)最少，18月齡大鼠心肌組織和血清中TNF-α含量與6月齡大鼠組比較明顯增加(P<0.05)，26月齡大鼠與18月齡及6月齡大鼠相比，心肌組織中和血清中TNF-α水平均有顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表3。

圖4 各組大鼠左室心肌組織中TNF-α的表達(dá)(DAB，×200)

表3 不同月齡大鼠心肌組織和血清TNF-α含量比較

2.6各組大鼠心功能參數(shù)及心肌組織和血清中TNF-α含量的相關(guān)性 各組大鼠心功能參數(shù)IVSD、LVESD、LVEDD、E/E′和CVF%與心肌組織及血清中TNF-α顯著正相關(guān)(P<0.05)，LVEF、LVFS、E/A與TNF-α水平顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 各組大鼠心功能參數(shù)與TNF-α的相關(guān)性

3 討 論

超聲心動(dòng)圖與心臟磁共振(CMR)、心臟核素顯像等技術(shù)相比具有無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)便、重復(fù)性好等優(yōu)勢(shì)，在臨床上被廣泛用于心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的評(píng)價(jià)。M型心臟超聲、二尖瓣血流頻譜和組織多普勒在心臟評(píng)估中最為常用〔10,11〕。年齡是影響心臟結(jié)構(gòu)和功能的重要因素。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著大鼠月齡的增加，心臟結(jié)構(gòu)和功能逐漸變差。

同時(shí)，本研究還從病理學(xué)檢測(cè)考察了增齡性對(duì)心臟病理改變的影響。有研究表明，患者在早期心臟舒張功能有輕度減退，中期心肌細(xì)胞凋亡或死亡,心臟舒張功能異?；蜉p度收縮功能異常，晚期則會(huì)有微血管病變,心臟舒張功能、收縮功能異?！?2〕。隨著大鼠月齡的增加，本研究脈沖多普勒發(fā)現(xiàn)心臟減速時(shí)間延長(zhǎng),提示心臟舒張功能減退。此時(shí)，心臟心肌組織伴隨明顯的病理改變，最顯著的就是心肌纖維化。本研究結(jié)果說(shuō)明，增齡性帶來(lái)的心臟病理改變是隨著月齡的增加，心肌間質(zhì)會(huì)有大量膠原纖維沉積，尤其是老年化大鼠最為顯著。膠原纖維在心肌細(xì)胞間質(zhì)大量沉積進(jìn)而導(dǎo)致心肌順應(yīng)性下降,舒張功能減退。增齡性伴隨的心肌細(xì)胞攣縮、肌原纖維收縮帶形成,細(xì)胞水腫,線粒體變性外逸,融合、漂浮,結(jié)構(gòu)不清,心肌細(xì)胞內(nèi)多處出現(xiàn)脂褐素等老化現(xiàn)象，提示心肌退行性變加重，因而心臟結(jié)構(gòu)異常，功能減退。

研究表明〔13～15〕，促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-6等均能直接影響心肌收縮功能，并導(dǎo)致心衰。本研究提示隨著SD大鼠的老年化，心臟組織中存在過(guò)度的炎癥反應(yīng)及免疫功能紊亂，最終可能引發(fā)心肌纖維化，心力衰竭，從而導(dǎo)致死亡。

綜上所述，SD大鼠隨著老年化會(huì)出現(xiàn)心臟結(jié)構(gòu)異常和心臟功能減退的現(xiàn)象，同時(shí)伴隨明顯的心肌細(xì)胞的病理改變。老齡性心臟結(jié)構(gòu)及功能的異常與炎癥因子的表達(dá)水平存在相關(guān)性。