八角茴香滲漉法的工藝優(yōu)化及莽草酸的薄層色譜鑒別

周邦華 ，龍杰鳳，王小羽，湯承浩，譚 榮，李本鵬，王 翔，2*

（1.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011；2.凱里學(xué)院黔東南民族藥綜合利用工程技術(shù)研究中心，貴州凱里 556011；3.沈陽藥科大學(xué)，遼寧沈陽 117000）

八角茴香（Illicium verum）為木蘭科八角屬植物的干燥成熟果實(shí)，為著名的調(diào)味香料，果皮、種子、葉都含芳香油，是制造化妝品、甜香酒、啤酒和食品工業(yè)的重要原料［1-2］.八角茴香除用作香料外，還用于治療消化不良、胃痛、小兒氙氣以及面部麻痹等［3］.研究表明，其主要藥效成分莽草酸及其衍生物通過影響花生四烯酸代謝，抑制血小板聚集和抑制動、靜脈血栓及腦血栓形成，并具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗血栓、抗腦缺血等作用［4-5］.而且還是合成抗禽流感藥物“達(dá)菲”的關(guān)鍵原料，可作為抗病毒和抗癌藥物中間體在醫(yī)藥、食品等行業(yè)廣泛應(yīng)用［6］.

八角茴香果實(shí)一般含莽草酸3%～10%，目前，文獻(xiàn)報(bào)道提取莽草酸的方法有超聲-微波協(xié)助提取法、水蒸氣蒸餾法、超臨界萃取法、溶劑回流提取法等［7-8］，而相較于傳統(tǒng)的滲漉法提取分離技術(shù)，不難發(fā)現(xiàn)，以上提取方法相對耗能，成本較高，往往因加熱等因素會造成部分成分結(jié)構(gòu)的破壞而影響藥效.值得一提的是，筆者搜索知網(wǎng)等大型數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，利用滲漉法這一傳統(tǒng)溶劑提取法提取八角茴香中的莽草酸并進(jìn)行薄層鑒別及純化分離的文獻(xiàn)報(bào)道實(shí)屬罕見.因此，本文采用滲漉法、UV 法和薄層色譜鑒別法，通過單因素試驗(yàn)和L9（34）正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察乙醇濃度、料液比、提取時間、藥材粒度、滲漉速度與滲漉次數(shù)對八角茴香提取工藝的影響，建立八角茴香滲漉液中莽草酸含量測定及定性鑒別的方法，以期為后續(xù)開展八角茴香中莽草酸的進(jìn)一步分離純化奠定基礎(chǔ).

1 藥材、試劑及儀器

1.1 藥材及試劑

本實(shí)驗(yàn)所用藥材為八角茴香（Illicium verum）（批號：20181101，安徽四全藥業(yè)銷售有限公司），經(jīng)凱里學(xué)院王翔教授鑒定為木蘭科八角屬植物的干燥成熟果實(shí)，實(shí)驗(yàn)樣品保存在凱里學(xué)院民族藥標(biāo)本館.

本實(shí)驗(yàn)所用試劑有莽草酸對照品（批號：111835-201503，中國食品藥品檢定研究院，純度99.7%）；乙酸乙酯（西隴科學(xué)股份有限公司），三氯甲烷（重慶川東化工有限公司），甲酸（成都金山化學(xué)試劑有限公司），乙醇和甲醇（深圳市科天化玻儀器有限公司），正己烷、石油醚和丙酮（天津市東麗區(qū)天大化學(xué)試劑廠），以上均為分析純.

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

紫外分光光度計(jì)（上海儀電分析儀器有限公司，L5 型），磁力攪拌器（上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司，CL-2 型恒溫加熱型），電子天平（奧豪斯儀器（上海）有限公司，AR224CN 型），恒溫水浴鍋（常州天瑞儀器有限公司，HH-8 數(shù)顯恒溫型），潔拓超聲波清洗機(jī)（深圳市潔拓超聲波清洗設(shè)備有限公司），電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京中興信業(yè)儀器有限公司，10-1A型）等.

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 八角茴香藥材處理及水分測定

取八角茴香藥材飲片適量，篩選，粉碎過篩，分別制成3 批樣品S1、S2、S3，置于干燥器備用.按照ChP2015（通則0832）第二法（烘干法）測定［1］.見表1，結(jié)果八角茴香水分在12.15%～13.28%，平均值12.97%，低于相關(guān)規(guī)定的13.00%，表明藥材保存完好，符合實(shí)驗(yàn)要求.

式中：M1為干燥前樣品+稱量瓶重量（g），M2為樣品重量（g），M3為干燥后樣品+稱量瓶重量（g）.

表1 八角茴香水分測定結(jié)果

2.2 干膏得率測定

按照ChP2015（通則0832）法測定［1］.取供試品溶液25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，在100～105 ℃干燥3 h，移置干燥器中，放冷30 min，精密稱定，再在上述溫度干燥1 h，放冷，稱重，至連續(xù)2 次稱重的差異不超過5 mg 為止.根據(jù)減失的重量，計(jì)算樣品中的含水量.

2.3 八角茴香滲漉液中莽草酸含量測定

2.3.1 供試品溶液制備

參照2015 版《中國藥典》八角茴香飲片鑒別項(xiàng)下供試品溶液制備方法并適當(dāng)調(diào)整［1，9-11］，即精密吸取滲漉提取液10 mL，加入10 mL 石油醚-乙酸乙酯（1：1）溶液，超聲處理10 min，77 ℃揮去上層液，加甲醇定容至25 mL，即得供試品溶液.

2.3.2 對照品溶液制備

精密稱取10.0 mg 莽草酸對照品，置于50 mL容量瓶中，用甲醇溶解至刻度，即得0.2 mg/mL的對照品溶液［12］.

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

精密稱取0.2 g 莽草酸對照品，用95 %乙醇定容于100 mL量瓶中，汲取1、3、5、7、9 mL置于10 mL量瓶中，再分別加95%乙醇定容至刻度，以空白試劑作參比，在227 nm 波長［11，13］處照紫外分光光度法測定莽草酸系列濃度的吸光度值，以莽草酸濃度（C）為橫坐標(biāo)，吸光度（A）值為縱坐標(biāo)，繪制莽草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1.結(jié)果回歸方程為y=0.5446x+0.1383，r=0.9992，表明在0.2～1.4 mg/mL 時，莽草酸濃度（C）對吸光度（A）有良好的線性關(guān)系.

圖1 莽草酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

2.3.4 精密度考察

精密量取2.3.2 項(xiàng)下同一濃度莽草酸對照品溶液，照2.3.3項(xiàng)下測定方法，連續(xù)進(jìn)樣6次，比較吸光度.結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.5%，小于2%，表明所用儀器精密度良好.

2.3.5 重復(fù)性考察

精密量取同批八角茴香滲漉液6份，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，照2.3.3項(xiàng)下測定方法重復(fù)進(jìn)行測定，比較吸光度的RSD.結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD為2.1%，表明重復(fù)性良好，滿足分析要求.

2.3.6 穩(wěn)定性考察

精密量取八角茴香滲漉液，按2.3.1 項(xiàng)下制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、10、12 h 時，照2.3.3 項(xiàng)下測定方法測定，比較吸光度，結(jié)果相對標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.03%，小于2%，表明樣品供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好，符合要求.

2.3.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取莽草酸已知濃度為0.5793 mg/mL 的八角茴香滲漉供試品溶液5 mL，6 份，各加70%乙醇定容于10 mL 量瓶中，分別按樣品中莽草酸含量的50%、100%、150%加入莽草酸標(biāo)準(zhǔn)品，混勻，按2.3.1 項(xiàng)下制備供試品溶液，依法測其吸光度并計(jì)算加樣回收率和RSD 值，見表2.結(jié)果樣品平均加樣回收率為98.89%，RSD 為1.74%，表明在規(guī)定范圍內(nèi)，符合要求.

表2 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.3.8 含量測定

稱取八角茴香樣品約5 g，平行3 次，照優(yōu)化的工藝條件制得滲濾液，照2.3.1 項(xiàng)下制備方法制備供試品溶液，測定吸光度，帶入2.3.3 項(xiàng)下回歸方程，計(jì)算樣品中莽草酸含量，結(jié)果見表3，測得樣品中莽草酸平均含量為9.40%.

其中W為樣品中莽草酸百分含量，V1為滲漉液總體積（mL），V2為從滲漉液總體積中取出的體積（mL），V3為待測液體積（mL），M為八角粉末取樣量（mg），C為回歸方程讀取的質(zhì)量濃度（mg/mL）.

表3 含量測定結(jié)果

2.4 提取工藝研究

2.4.1 單因素實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)根據(jù)各指標(biāo)因素對提取工藝影響的貢獻(xiàn)大小分配權(quán)重系數(shù)［14-16］，即分別設(shè)定莽草酸和干膏得率的權(quán)重系數(shù)為0.6和0.4，采用綜合評分法評分.綜合評分=（W莽草酸含量/W莽草酸含量最大值）*0.6+（W干膏率/W干膏率最大值）*0.4.

2.4.1.1 乙醇濃度考察

保持其他因素不變，稱取藥材粉末（80目篩）5 g，在料液比為1：10 g/mL，浸泡時間12 h 時，30%、50%、70%、90%乙醇濃度對八角茴香莽草酸含量和干膏得率及綜合評分的影響見圖2，結(jié)果表明，相較于其他濃度，70%的乙醇濃度提取效果較好，故選擇70%的乙醇溶液.

圖2 乙醇濃度考察

2.4.1.2 料液比考察

保持其他因素不變，稱取藥材粉末（80 目篩）約5 g，浸泡時間12 h，乙醇濃度70%時，料液比為1：10、1：15、1：20、1：25、1：30、1：35 g/mL 對八角茴香莽草酸含量和干膏得率及綜合評分的影響見圖3，結(jié)果顯示，相較于其他料液比，料液比1：10 g/mL時效果較好，選擇料液比1：10 g/mL.

圖3 料液比考察

2.4.1.3 浸泡時間考察

稱取藥材粉末（80 目篩）約5 g，乙醇濃度為70%，料液比為1：10 g/mL 時，保持其他因素不變，泡時間為6、12、18、24、30、36、42 h對八角茴香莽草酸含量和干膏得率及綜合評分的影響見圖4，由圖知，浸泡時間為12 h 時效果較好，故選擇浸泡時間為12 h.

圖4 浸泡時間考察

2.4.1.4 粒度考察

稱取藥材粉末約5 g，乙醇濃度為70%，料液比為1：10 g/mL，浸泡時間12 h 時，保持其他因素不變，藥材粒度（20 目、40 目、60 目、80 目、100 目）對八角茴香莽草酸含量和干膏得率及綜合評分的影響如圖5，由圖分析，粒度為80目時效果較好，故選擇80目.

圖5 粒度考察

2.4.1.5 提取次數(shù)考察

保持其他因素不變，稱取藥材粉末（80 目篩）約5 g，乙醇濃度為70%，料液比為1：10 g/mL，浸泡時間12 h 時，考察滲漉1、2、3 次對八角茴香莽草酸含量和干膏得率及綜合評分的影響如圖6，結(jié)果顯示，滲漉數(shù)1次時的測定結(jié)果較好，故選擇滲漉1次即可.

圖6 提取次數(shù)考察

2.4.1.6 滲漉流速考察

稱取藥材粉末（80 目篩）約5 g，乙醇濃度為70%，料液比為1：10 g/mL，浸泡時間12 h 時，保持其他因素不變，滲漉流速1、2、3 mL/min 對八角茴香莽草酸含量和干膏得率及綜合評分的影響見圖7，結(jié)果顯示在滲漉1 次的情況下，流速1 mL/min時，結(jié)果較優(yōu).故選擇滲漉流速1 mL/min.

圖7 滲漉流速考察

2.4.2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)［14-18］方法進(jìn)行測定，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以莽草酸含量及干膏率及綜合評分為考察指標(biāo)，選取浸泡時間（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）為考察因素，按L9（34）正交設(shè)計(jì)表進(jìn)行滲漉法提取實(shí)驗(yàn)，因素水平見表4，正交實(shí)驗(yàn)安排及結(jié)果見表5，方差分析見6.

表4 因素-水平表

表5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)安排與結(jié)果

表6 方差分析結(jié)果

結(jié)果表明，由上表的直觀分析和極差分析結(jié)果可以看出，極差RC＞RB＞RA，3 個因素對莽草酸提取率的影響依次為：乙醇濃度（C）＞料液比（B）＞浸泡時間（A），各因素中乙醇濃度的影響最為顯著，料液比次之，浸泡時間影響較小，后兩者的作用相當(dāng).在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)范圍內(nèi)，綜合生產(chǎn)實(shí)際和單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，評估因素水平取值，預(yù)測可能的最佳工藝條件為A2B2C1，即乙醇濃度60%、浸泡時間12 h，料液比1：15 g/mL.

2.4.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取80目八角茴香粉末3份（平行3份），約0.5 g，根據(jù)正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)論預(yù)測的工藝條件A2B2C1進(jìn)行滲漉提取，照2.3.1項(xiàng)下制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下測定方法進(jìn)行測定，結(jié)果見表7.結(jié)果表明：莽草酸平均含量為9.40%，高于正交試驗(yàn)表5 中的每一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，故A2B2C1條件即乙醇濃度60%、浸泡時間12 h，料液比1：15 g/mL 為滲漉法最佳提取工藝條件.

表7 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果表

2.5 八角茴香提取物中莽草酸的薄層色譜鑒別

2.5.1 供試品溶液制備

收集最優(yōu)工藝條件下的滲漉液，濾過，60 ℃真空濃縮干燥，粉粹過篩（80 目），精密稱取干膏粉末約0.5 g，參照2.3.1項(xiàng)下供試品溶液制備方法，制成20 mg/mL的供試品溶液.

2.5.2 對照品溶液制備

精密稱取莽草酸對照品適量，參照2.3.2 項(xiàng)下對照品溶液制備方法，制成1 mg/mL 的對照品溶液.

2.5.3 薄層鑒別方法（參照文獻(xiàn)［1，12］并適當(dāng)調(diào)整展開劑系統(tǒng)）

2.5.3.1 薄層色譜點(diǎn)樣量考察

分別精密吸取供試品、對照品各1、2、3、4、5、6μL點(diǎn)于同一種硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷-甲醇-正己烷-甲酸（5：1.5：1：0.1）為展開劑展開，取出，晾干，噴1%的硫酸溶液的1%的高錳酸鉀溶液，如圖8.結(jié)果表明點(diǎn)樣量為3μL、Rf 為0.56 時，可較好分離，故選擇點(diǎn)樣量為3μL.

圖8 薄層色譜點(diǎn)樣量考察

2.5.3.2 薄層色譜溫度考察

精密吸取供試品、對照品各3μL，分別在環(huán)境為5 ℃、16 ℃、20 ℃、室溫、25 ℃、30 ℃下，保持其他條件不變照上述鑒別方法操作，結(jié)果如圖9，顯示溫度為25 ℃，Rf 為0.46 時，分離效果較好，故選擇溫度為25 ℃.

圖9 薄層色譜溫度考察

2.5.3.3 薄層色譜濕度考察

精密吸取供試品、對照品各3 μL，溫度為25 ℃，保持其他條件不變照上述鑒別方法操作，20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的濕度環(huán)境下的結(jié)果如圖10，提示濕度40%，Rf 為0.54 時，分離效果較好，故濕度選擇40%.

圖10 薄層色譜濕度考察

2.5.3.4 薄層色譜板考察

在溫度為25 ℃，濕度40%下，精密吸取供試品、對照品各3 μL 分別點(diǎn)于硅膠G 薄層板、硅膠GF254薄層板、自制薄層板和聚酰胺薄膜上，保持其他條件不變照上述鑒別方法操作，結(jié)果如圖11，結(jié)明薄層板為硅膠GF254、Rf 為0.63 時效果較好，故選擇硅膠GF254薄層板.

圖11 薄層色譜板考察

2.5.3.5 薄層色譜展開劑考察

在溫度為25 ℃，濕度40%時，精密吸取供試品、對照品各3 μL 分別以①三氯甲烷-甲醇-正己烷-甲酸（5：1.5：1：0.1）、②三氯甲烷-甲醇（6：4）、③石油醚-丙酮-乙酸乙酯（19：1：1）為展開劑，保持其他條件不變照上述鑒別方法操作，結(jié)果如圖12，表明展開劑為①三氯甲烷-甲醇-正己烷-甲酸（5：1.5：1：0.1）、Rf 為0.52 時斑點(diǎn)分離清晰，故選擇①為展開劑.

圖12 薄層色譜展開劑考察

2.5.3.6 薄層色譜鑒別最終確定條件

參照薄層色譜法（附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取供試品溶液和對照品溶液各3 μL，點(diǎn)于硅膠GF254薄層板上，在溫度為25℃、濕度為40%的條件下，以三氯甲烷-甲醇-正己烷-甲酸（5：1.5：1：0.1）為展開劑展開，取出，晾干，噴以1%的硫酸溶液的1%的高錳酸鉀溶液，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，莽草酸最佳條件下的薄層色譜如圖13.

圖13 莽草酸的薄層色譜圖（1.八角茴香供試品溶液；2.莽草酸對照品溶液；3.空白溶液）

3 討論

本實(shí)驗(yàn)單因素試驗(yàn)結(jié)果研究表明，當(dāng)乙醇濃度為70%、料液比1：10 g/mL、粒度80 目、滲漉時間為12 h、提取次數(shù)為第1 次、滲漉流速1 mL/min（慢）時，結(jié)果最優(yōu)；正交試驗(yàn)及驗(yàn)證試驗(yàn)研究結(jié)果表明，當(dāng)乙醇濃度為60%、料液比1：15 g/mL、滲漉時間12 h 時，測得八角茴香中的莽草酸含量最高達(dá)9.45%，正交試驗(yàn)優(yōu)化的八角茴香滲漉法提取工藝研究結(jié)果較好.

本設(shè)計(jì)完成了八角茴香水分、干膏得率、莽草酸含量的測定及提取物中莽草酸的鑒別研究，對精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和加樣回收率等進(jìn)行了方法學(xué)考察，在單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)基礎(chǔ)上優(yōu)化滲漉法提取莽草酸工藝參數(shù).該方法操作簡便，工藝穩(wěn)定，可為后期八角茴香中莽草酸的分離純化研究提供實(shí)驗(yàn)參考.