高效液相色譜法靈香草中槲皮素含量

蔣向輝，楊永平，譚 榮

（1.凱里學(xué)院，貴州凱里 556011；2.貴州奧特藥業(yè)有限公司，貴州凱里 556011）

靈香草（Lysimachia foenum-graecumHance）系報(bào)春花科珍珠菜屬植物［1］，其味香氣濃，是我國(guó)特色的傳統(tǒng)藥用植物，其全草可以作藥用，常用于解熱、治牙痛、活血和驅(qū)蟲(chóng).當(dāng)前對(duì)有關(guān)靈香草化學(xué)成分的研究相對(duì)較少，可能與靈香草揮發(fā)性成分極大有關(guān)，現(xiàn)已分離并鑒定出β-谷甾醇、苯甲醇、棕櫚酸、百里香酚、三萜皂苷、苯乙酮、烯酸乙酯、香荊芥酚、豆衡醇、豆街醇、槲皮素等化合物［2］.大量的研究表明，靈香草中富含黃酮類(lèi)成分［3］，其中黃酮醇類(lèi)化合物槲皮素在多種藥材中是抗菌消炎和抗腫瘤的主要成分.但迄今為止對(duì)靈香草槲皮素含量的提取分離與測(cè)定的研究尚未見(jiàn)報(bào)道.

靈香草萃取物通常采用乙醇或甲醇等有機(jī)溶劑萃取，但以單一有機(jī)溶劑作為萃取物往往收率較低，并且由于靈香草中揮發(fā)性成分較多，在提取過(guò)程中導(dǎo)致類(lèi)黃酮損失較多，限制了靈香草類(lèi)黃酮的開(kāi)發(fā)與使用.本研究擬以2 mol/L的鹽酸甲醇溶液為提取溶劑提取靈香草類(lèi)黃酮，采用HPLC 檢測(cè)方法測(cè)定靈香草甲醇提取物中槲皮素含量，為靈香草藥材質(zhì)量的檢測(cè)和槲皮素的開(kāi)發(fā)利用提供技術(shù)參考.

1 試驗(yàn)材料

材料采自云南、廣西和貴州省的靈香草產(chǎn)區(qū)，由貴州奧特藥業(yè)有限公司提供（見(jiàn)表1）.

表1 供試樣品來(lái)源表

2 試驗(yàn)儀器與試劑

2.1 試驗(yàn)儀器

試驗(yàn)儀器有日本島津LC-30A 型高效液相色譜儀，Wondasil C18反向色譜柱，KQ2200DV超聲波清洗機(jī)，R-1002型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，萬(wàn)能粉碎機(jī)，101A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，BSA224SCW 電子分析天平和UV-8000雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì).

2.2 試驗(yàn)試劑

試驗(yàn)用試劑有乙酸乙酯和甲酸（購(gòu)自懷化新科儀化學(xué)試劑公司，均為色譜純），有機(jī)試劑甲醇、甲苯（購(gòu)自湖南長(zhǎng)沙華騰試劑有限公司），無(wú)機(jī)試劑鹽酸、氫氧化鈉等（購(gòu)自湖南懷化市玻璃儀器化學(xué)試劑有限公司），槲皮素對(duì)照品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所）.

3 試驗(yàn)方法

3.1 色譜條件選擇

色譜柱采用Wondasil C18 反向色譜柱，通過(guò)紫外掃描，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)槲皮素在波長(zhǎng)為375 nm 時(shí)有最大吸收，特將HPLC 檢測(cè)的波長(zhǎng)設(shè)定為375 nm.通過(guò)考察甲苯-乙酸乙酯-甲酸按不同比例混合（10∶6∶4，10∶5∶2和10∶8∶1）對(duì)峰形及分離度影響，將槲皮素標(biāo)準(zhǔn)液HPLC 圖與靈香草鹽酸甲醇提取液HPLC 圖進(jìn)行比較，當(dāng)甲苯-乙酸乙酯-甲酸配比為10∶8∶1 時(shí)保留時(shí)間相對(duì)穩(wěn)定，樣品分離明顯（見(jiàn)圖1）.由于槲皮素保留時(shí)間為19 min，時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，因此，加大流速為1.5 mL/min，延長(zhǎng)檢測(cè)時(shí)間到30 min，色譜柱溫度為實(shí)驗(yàn)室溫度（25 ℃）.

圖1 槲皮素對(duì)照品（A）與靈香草鹽酸甲醇提取液（B）的色譜圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制

3.2.1 對(duì)照品溶液的配制

槲皮素對(duì)照慢速離心后，稱(chēng)量5.0 mg，先用35～40 mL濃度為2 mol/L的鹽酸甲醇溶解，再用鹽酸甲醇定容至50 mL，即得100 μg/mL 的槲皮素對(duì)照品溶液，再?gòu)脑撊萘科恐蟹謩e量取2、3、4、5、6、7、8 mL槲皮素對(duì)照品溶液，用鹽酸甲醇定容至10 mL，制得濃度為20、30、40、50、60、70、80μg/mL 的槲皮素對(duì)照品溶液.

3.2.2 供試品溶液的制備

精密稱(chēng)取靈香草粉末0.5025，0.5050和0.5075 g三份，分別加入250 mL的玻璃圓底燒瓶，再加100 mL的鹽酸甲醇溶液，固定于回流冷凝裝置，調(diào)整溫度到80 ℃，回流加熱1.5 h，冷卻后，迅速減壓抽濾，將濾液置于80 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)30 min，得到約2 mL 鹽酸甲醇溶液，作為供試品溶液備用.

3.2.3 線(xiàn)性關(guān)系的考察

使用注射器量取上述不同濃度的母液1.5 mL，采用0.22μm 有機(jī)相系濾膜過(guò)濾，分別置于不同刻度試管中.按3.1得到的色譜條件，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，測(cè)定不同濃度槲皮素的峰面積，采用SPSS19.0 軟件分析槲皮素含量與峰面積之間的線(xiàn)性關(guān)系，得到線(xiàn)性回歸直線(xiàn)方程為y=78257x+43567，并以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），槲皮素的質(zhì)量體積比濃度為橫坐標(biāo)（X），得到線(xiàn)性曲線(xiàn)圖2，從圖中可以看出，當(dāng)槲皮素質(zhì)量體積比濃度在25～75μg/mL時(shí)，濃度與峰面積線(xiàn)性關(guān)系良好.

圖2 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

3.3 精密度試驗(yàn)

使用注射器吸取濃度為50μg/mL 的槲皮素對(duì)照品溶液1.5 mL，按3.1得到的色譜條件，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，測(cè)定不同濃度槲皮素的峰面積，共得6 組數(shù)據(jù)（n=6），最后數(shù)據(jù)及其處理結(jié)果如表2所示.從表2 可以看出，槲皮素峰面積標(biāo)準(zhǔn)偏差與計(jì)算結(jié)果算術(shù)平均值的比值，即相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.83%，小于2.0%，表明該高效液相色譜儀精密度較好.

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果

3.4 重復(fù)性試驗(yàn)

使用注射器分別吸取上述3.2.2所制備的供試品溶液1.5 mL，按3.1得到的色譜條件，進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)，測(cè)定不同濃度槲皮素的峰面積，共得6組數(shù)據(jù)（n=6），最后數(shù)據(jù)處理結(jié)果如表3所示.從表3可以看出，供試品峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為1.18 %（＜2.0 %），表明樣品制備過(guò)程穩(wěn)定、成分變化小，制備方法重復(fù)性好，用于測(cè)定槲皮素含量數(shù)據(jù)可靠.

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

按上述3.2.2法制備出槲皮素供試品溶液后，用移液器量取供試品溶液1.5 mL，并通過(guò)0.22μm有機(jī)相系濾膜過(guò)濾，分別于0，2，4，6，8，10 h等6個(gè)時(shí)間段進(jìn)行，進(jìn)樣穩(wěn)定性檢測(cè)，最后檢測(cè)數(shù)據(jù)及其處理如表4中所示.從表4可以看出，槲皮素供試品峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD 為2.17%，小于2.5%，表明槲皮素在10 h內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定，含量變化小，該檢測(cè)的方法可靠.

表4 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.6 加樣回收率試驗(yàn)

取靈香草（LXIlfg01）粉末2份，準(zhǔn)確稱(chēng)定質(zhì)量為0.5 025，0.5 104，0.5 003，0.5 163，0.5 107和0.4 933 g，按照上述3.3法制備6組槲皮素含量已知的靈香草供試品溶液，再分別向6 組供試品溶液加入1.8、2.0、2.2、1.8、2.0和2.2 mL濃度為100μg/mL的槲皮素對(duì)照品溶液，即分別加入18、20、22、18、20 和22μg 的槲皮素對(duì)照品，即得到6 組不同的加有不同量對(duì)照品的用于加樣回收檢測(cè)的供試品溶液.按3.1 所設(shè)定的HPLC色譜條件，參照3.2.3項(xiàng)方法測(cè)定不同樣品中槲皮素的峰面積，標(biāo)測(cè)混合后槲皮素檢測(cè)量，共得6 組數(shù)據(jù)（n=6），計(jì)算供試溶液中加入標(biāo)品后的加樣回收率.其數(shù)據(jù)及其處理結(jié)果如表5所示.

表5 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

由表中數(shù)據(jù)得出：槲皮素的加樣回收率為96.44%，在所規(guī)定范圍93.45%～100.75%內(nèi)，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.49%，未超過(guò)規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)（5%），即該方法較準(zhǔn)確.

4 含量測(cè)定結(jié)果與分析

4.1 提取液峰面積測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取7個(gè)不同來(lái)源的靈香草樣品0.5 025、0.5 050、0.5 075 g，按上述3.2.2 法制備出靈香草供試品溶液后，用注射器吸取供試品溶液1.5 mL，參照3.2.3 項(xiàng)方法用進(jìn)樣針精密吸取20 μL，根據(jù)3.1設(shè)定的色譜條件測(cè)定樣品槲皮素含量，最后數(shù)據(jù)如下表6所示.

表6 各產(chǎn)地靈香草中槲皮素的含量

續(xù)表6 各產(chǎn)地靈香草中槲皮素的含量

4.2 提取液中槲皮素濃度的計(jì)算

根據(jù)3.2.3得到的線(xiàn)性方程y=36 402x+58 412，可變換為x=（y-58 412）/36 402，根據(jù)峰面程計(jì)算得各產(chǎn)地靈香草中槲皮素的含量，計(jì)算結(jié)果如表6所示.由實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)可得出，各批次靈香草中都含有較多的槲皮素，以來(lái)自廣西來(lái)賓（LXIlfg04）的靈香草槲皮素含量相對(duì)較高，為0.723 mg/g，以來(lái)自貴州興義市（LXIlfg01）的靈香草槲皮素含量相對(duì)較低，為0.443 mg/g.

5 小結(jié)與討論

本研究為了測(cè)定靈香草中槲皮素含量，對(duì)靈香草槲皮素的提取液進(jìn)行了摸索，找到了提取率較高的鹽酸甲醇混合提取溶劑.由于槲皮素極性較蘆丁小，本研究采用反向色譜柱時(shí)，適當(dāng)加大流速到1.5 mL/min，保留時(shí)間19 min 時(shí)，槲皮素能得到較好的分離；通過(guò)流動(dòng)相甲苯、乙酸乙酯和甲酸的不同配比的篩選，找到了能有效分離靈香草槲皮素的理想配比，即甲苯：乙酸乙酯：甲酸=10∶8∶1；通過(guò)最大吸收波長(zhǎng)分析，找到了槲皮素的紫外檢測(cè)最大吸收波長(zhǎng)為375 nm；以槲皮素保留時(shí)間和峰面積進(jìn)行槲皮素定性與定量分析，峰面積與含量絕對(duì)相關(guān)系數(shù)是0.9998，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）變化范圍為1.83%～2.49%，加樣回收率平均為96.44%，表明采用HPLC 法檢測(cè)靈香草甲醇提取物中槲皮素含量靈敏度高、可重復(fù)性好，本研究為靈香草藥材成分的開(kāi)發(fā)利用提供了較好的參考.

本實(shí)驗(yàn)對(duì)槲皮素的提取方法進(jìn)行了改進(jìn)，劉少靜等［4］以55%的乙醇溶液為提取液，測(cè)得沙棘果粉中槲皮素含量為0.128 mg/mL，王珍等［5］以70% 的乙醇為提取液，測(cè)得山楂中槲皮素含量為0.664 mg/mL，本研究選用鹽酸甲醇的混合溶液為提取液，再通過(guò)回流提取后得到靈香草中槲皮素含量最高為0.723mg/mL.在本研究中靈香草槲皮素色譜峰保留時(shí)間較長(zhǎng)，但能將槲皮素從類(lèi)黃酮中較好地分離出來(lái)，這為今后從其它藥材中分離槲皮素類(lèi)黃酮提供了較好的參考.