雞屎藤蒸餾物的免疫增強(qiáng)效果評價(jià)

朱鋒釗 吳強(qiáng) 楊帆 段俊紅 羅杰

摘要：在對雞進(jìn)行新城疫免疫的同時(shí)，利用雞屎藤蒸餾物滴鼻，研究了雞屎藤蒸餾物對雛雞脾臟、法氏囊等免疫器官和機(jī)體抗體水平的影響。研究結(jié)果表明，雞屎藤蒸餾物可顯著促進(jìn)雛雞脾臟（p<0.05）、法氏囊（p<0.01）等免疫器官的發(fā)育和增長，顯著提升雛雞抗體水平（p<0.01）。因此，雞屎藤蒸餾物可顯著增強(qiáng)雞新城疫疫苗的免疫效果，可開發(fā)為雞新城疫疫苗的免疫佐劑。

關(guān)鍵詞：雞屎藤;蒸餾物;新城疫;免疫佐劑

近年來，隨著我國養(yǎng)雞業(yè)的高速發(fā)展和集約化養(yǎng)殖程度的不斷提高，疾病傳播機(jī)會(huì)也大大增加，再加上病原結(jié)構(gòu)變異增加，亞臨床型感染病例逐漸增多，多種類型病原混合感染，疫苗免疫效果往往不佳，出現(xiàn)雞只免疫接種后一些傳染病仍然暴發(fā)流行的情況。雞新城疫（Newcastle disease，ND）是由副粘病毒引起的雞高度接觸性、急性和烈性傳染病，感染率和致死率均較高，嚴(yán)重危害養(yǎng)雞業(yè)的發(fā)展。最常用的預(yù)防方式是接種疫苗，為保證抗體效價(jià)達(dá)到期望的水平，疫苗常與免疫增效劑共同使用。作為免疫佐劑，中草藥具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其卓越的雙向調(diào)節(jié)功能和較小的毒副作用已得到醫(yī)學(xué)界的普遍認(rèn)可。雞屎藤是一種常用中草藥，含有豐富的揮發(fā)油活性成分，如芳樟醇、松油醇、樟腦、丁香酚等，具有抗菌、抗應(yīng)激、鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜、抗驚厥等多種藥理活性。雞屎藤可作為雛雞墊料用于預(yù)防多種雞傳染性疫病，其揮發(fā)油還可通過口腔、鼻黏膜、眼結(jié)膜、皮膚等多種途徑進(jìn)入機(jī)體，提升雛雞小腸橫斷面肥大細(xì)胞數(shù)量，降低感染腸炎沙門氏菌患雞小腸隱窩深度，提高脾臟、法氏囊指數(shù)，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞的增殖，表現(xiàn)出對雛雞特異性與非特異性免疫力的提升作用，特別是黏膜免疫的激活作用。因此，雞屎藤揮發(fā)油為主要成分研制雞屎藤滴鼻劑并評價(jià)其免疫增強(qiáng)效果，可為免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)與臨床應(yīng)用提供參考。

一、儀器與材料

（一）主要試驗(yàn)儀器

Microfuge 22R高速冷凍臺式離心機(jī)（美國貝克曼庫爾特有限公司生產(chǎn)）;R124CN電子分析天平（奧豪斯國際貿(mào)易（上海）有限公司生產(chǎn)）;P100微量可調(diào)移液器（瑞士Soco-rex生產(chǎn)）;HH-8數(shù)顯恒溫水浴鍋（江蘇省金壇市恒豐儀器制造有限公司生產(chǎn)）;SHZ-82振蕩培養(yǎng)箱（常州華普達(dá)教學(xué)儀器有限公司生產(chǎn)）;YX-280D高壓滅菌鍋（合肥華泰醫(yī)療設(shè)備有限公司生產(chǎn)）;FA-N分析天平（天津市精拓儀器科技有限公司生產(chǎn)）;以及冰箱、96孔V型微量血凝板、滴頭等儀器耗材。

（二）試劑

雞屎藤蒸餾物，由民族中獸藥分離純化國家地方聯(lián)合工程中心提取，并用蒸餾水制成混懸液，雞屎藤蒸餾物與蒸餾水的比例分別為3：3（高濃度），2：3（中濃度）和1：3（低濃度），原料藥采于貴州省銅仁市松桃縣;雞新城疫疫苗、生理鹽水、肝素鈉等。

（三）飼料

二、試驗(yàn)方法

（一）試驗(yàn)動(dòng)物分組

1日齡三黃雞80只，在實(shí)驗(yàn)室條件下孵化，用不含任何抗菌藥物的全價(jià)飼料飼喂至7日齡。稱重后隨機(jī)將其分成雞屎藤蒸餾物高劑量組、中劑量組、低劑量組、對照組共4個(gè)組，每組20只雞，共計(jì)80只雛雞用于試驗(yàn)。

（二）試驗(yàn)過程、病理造模、臨床觀察

在第7日齡，對所有雞只采用雞新城疫疫苗滴鼻免疫。從第8日齡起，每天針對高劑量組、中劑量組、低劑量組分別采用高濃度（0.3mL/0.3mL）、中濃度（0.2mL/0.3mL）、低濃度（0.1mL/0.3mL）各0.3mL滴鼻給藥，對照組采用蒸餾水0.3mL滴鼻，連續(xù)用藥7天。

（三）抗體水平測定

連續(xù)用藥7天后，從存活的雛雞中隨機(jī)抽取5只，稱重后用一次性注射器空腹翅根靜脈采血并抗凝處理（抗凝劑與血液比例1：4），放入冰箱帶回試驗(yàn)室，采用新城疫抗體檢測技術(shù)，檢測抗體增長情況。

（四）臟器指數(shù)測定

在以上實(shí)驗(yàn)的同時(shí)，脫臼處死上述試驗(yàn)雞只，采集分離脾臟、法氏囊并稱重。臟器指數(shù)計(jì)算公式如下：

臟器指數(shù)=所測日齡器官重/所測日齡體重×100%

（五）數(shù)據(jù)處理

用PASWStatistics18分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)、分析、處理，以平均值和標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，并用t檢驗(yàn)進(jìn)行樣本均數(shù)差異顯著性檢驗(yàn)。

三、結(jié)果

（一）臨床觀察

從圖1直觀分析可以看出，高劑量組、中劑量組、低劑量組法氏囊外觀體積均明顯增大，并且在高劑量組、中劑量組、低劑量組法氏囊增大情況較為均勻。從圖2直觀分析可以看出，高劑量組、中劑量組、低劑量組亦出現(xiàn)了一定程度的增大，個(gè)別增大特別明顯并且外觀體積明顯大于對照組，但在高劑量組、中劑量組、低劑量組之間，均有個(gè)別增大的情況，高劑量組、中劑量組、低劑量組之間則看不出明顯差異。以上結(jié)果表明，雞屎藤蒸餾物具有促進(jìn)雛雞法氏囊、脾臟等免疫器官發(fā)育與增長的作用，但未見明顯的劑量相關(guān)性。

（二）抗體水平直觀分析

從圖3、圖4等反應(yīng)板直觀分析發(fā)現(xiàn)，陰性與陽性對照顯示正常，說明本試驗(yàn)檢測方法可行。對比分析高劑量組、中劑量組、低劑量組和對照組抗體檢測水平發(fā)現(xiàn)，高劑量組、中劑量組和低劑量組抗體水平與劑量呈正相關(guān)，劑量越大，抗體水平提升越明顯，并且均明顯高于對照組。以上結(jié)果表明，雞屎藤蒸餾物具有提升機(jī)體抗體水平的作用，并且與其劑量呈正相關(guān)。

（三）臟器指數(shù)及抗體水平

從表1可以看出，在脾臟臟器指數(shù)方面，中劑量組和低劑量組均顯著高于對照組（P<0.05），但高劑量組、中劑量組和低劑量組間未見顯著性差異。在法氏囊臟器指數(shù)方面，中劑量組極顯著高于對照組（P<0.01），中劑量組亦極顯著于高劑量組和中劑量組（P<0.01），高劑量組和低劑量組均顯著高于對照組（P<0.05），但高劑量組與低劑量組之間卻未見顯著性差異。在抗體滴度方面，高劑量組和低劑量組均極顯著高于對照組（P<0.01），中劑量組顯著高于對照組（P<0.05），但高劑量組、中劑量組和低劑量組之間未見顯著性差異。以上研究結(jié)果表明，雞屎藤蒸餾物具有明顯的促進(jìn)脾臟和法氏囊發(fā)育與增長的作用，亦具有明顯提高機(jī)體抗體水平的作用，但不具有劑量依賴性，中劑量和低劑量效果更加明顯。

四、討論與結(jié)論

21世紀(jì)，生命科學(xué)的蓬勃發(fā)展與人類返樸歸真、崇尚自然的科學(xué)熱潮，給中獸醫(yī)的振興提供了良好的機(jī)遇。作為科技前沿的現(xiàn)代蛋白質(zhì)合成技術(shù)和基因重組技術(shù)已經(jīng)可以研制出新型優(yōu)良佐劑，但其免疫激活作用較弱。中草藥以其低殘留、低毒性，且能調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫機(jī)能和不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)點(diǎn)，受到了廣大獸醫(yī)工作者的高度關(guān)注。作為免疫佐劑，中草藥具有獨(dú)特的優(yōu)勢，其卓越的雙向調(diào)節(jié)功能和較小的毒副作用已得到世界醫(yī)學(xué)界的普遍認(rèn)可，中草藥免疫佐劑將成為新世紀(jì)免疫增強(qiáng)劑研究的重點(diǎn)對象。雞屎藤為茜草科植物毛雞屎藤的全草，在民間（特別是少數(shù)民族地區(qū)）廣泛應(yīng)用，具消食健胃、益氣補(bǔ)虛、止咳、止痛、清熱解毒、祛風(fēng)活血、行氣解郁等功效，可通過熏蒸、內(nèi)服等途徑用于防治畜禽傳染性或非傳染性腹瀉病，如食積停滯、消化不良、疳積、胃腸瘀痛、熱毒瘡瘍等胃腸道疾病。雞屎藤在常溫下就有一種特殊氣味，在貴州及四川一些偏遠(yuǎn)山區(qū)，常將雞屎藤用作雛雞墊料，用于預(yù)防雛雞腹瀉病，并且均取得了較好的預(yù)防效果。

首先，從雞屎藤蒸餾物對免疫器官的直觀分析看出，雞屎藤蒸餾物具有促進(jìn)雛雞法氏囊、脾臟等免疫器官發(fā)育與增長的作用，說明雞屎藤蒸餾物對機(jī)體免疫力增強(qiáng)具有顯著的促進(jìn)作用。雞屎藤揮發(fā)油可以激活機(jī)體的腸粘膜免疫系統(tǒng)而激發(fā)機(jī)體粘膜免疫，本研究采用雞屎藤蒸餾物滴鼻給藥，作用靶位在機(jī)體呼吸系統(tǒng)粘膜，并激活了機(jī)體全身免疫系統(tǒng)，說明雞屎藤蒸餾物對激活機(jī)體粘膜免疫具有普遍性意義，但其呼吸系統(tǒng)激活機(jī)制和途徑有待進(jìn)一步研究與證實(shí)。其次，已有研究表明，雞屎藤富含氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素樣物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)，可增加機(jī)體抵抗力和抗應(yīng)激能力。但本研究直接采用雞屎藤蒸餾物滴鼻，并且通過雞屎藤蒸餾物對抗體水平作用效果的直觀分析和抗體水平差異顯著性比較可知，雞屎藤蒸餾物具有明顯提升機(jī)體抗體水平的作用，進(jìn)一步說明了雞屎藤蒸餾物對雛雞免疫水平的提升作用具有重要的針對性作用，不僅僅只是通過其營養(yǎng)作用而實(shí)現(xiàn)其對機(jī)體免疫力的提升，其作用可能是通過其對免疫器官生長的促進(jìn)作用和T淋巴細(xì)胞增殖的促進(jìn)作用來實(shí)現(xiàn)的。第三，雞屎藤蒸餾物對免疫器官及抗體水平的影響不具有劑量依賴性，中劑量和低劑量組作用效果更加明顯，可能與雞屎藤蒸餾物對肥大細(xì)胞等粘膜免疫細(xì)胞或者T淋巴細(xì)胞等免疫細(xì)胞的激活有關(guān)，僅需要適量劑量的雞屎藤蒸餾物即可激活機(jī)體粘膜免疫系統(tǒng)，從而發(fā)揮其粘膜免疫作用。

綜上所述，雞屎藤蒸餾物具有重要的免疫佐劑作用，可以在雞新城疫免疫時(shí)，配合雞屎藤蒸餾物滴鼻給藥，并表現(xiàn)出促進(jìn)免疫器官發(fā)育與增長，提升機(jī)體免疫水平的作用，但其作用機(jī)理及其是否可以配伍其他疫苗使用，有待進(jìn)一步研究。

（責(zé)任編輯 馮會(huì)利）