硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的體外藥物釋放和抗菌性能*

楊小平 隆麗娜 楊英年 梁萍 羅蘭 黎錦麗 梁周 龐科 鄒崇祺 羅善超*

負(fù)載抗生素的PMMA 是治療慢性骨髓炎的有效局部緩釋系統(tǒng)[1-2]。該局部抗生素緩釋系統(tǒng)具有以下優(yōu)勢(shì): 在感染部位釋放高濃度抗生素，同時(shí)消除外科清創(chuàng)后的死腔，并且保持較低水平的血清藥物濃度。但是負(fù)載抗生素的 PMMA也存在一些缺點(diǎn)，主要缺點(diǎn)之一是在初始階段抗生素呈爆發(fā)釋放，然后呈現(xiàn)持續(xù)的低于治療濃度的藥物釋放[3]。由于負(fù)載抗生素PMMA 的不可生物降解性質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間的低于治療藥物濃度的抗生素釋放可導(dǎo)致局部細(xì)菌增殖和生物膜形成，這可能導(dǎo)致耐藥細(xì)菌的產(chǎn)生和感染的復(fù)發(fā)[4]。負(fù)載抗生素的PMMA 的上述缺點(diǎn)影響了其抗感染效果和在臨床實(shí)踐中的應(yīng)用。因此，為了應(yīng)對(duì)這一嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，研發(fā)能夠持續(xù)釋放高于治療藥物濃度，從而提高抗菌作用的緩釋系統(tǒng)顯得尤為重要。鑒于負(fù)載抗生素PMMA 的缺點(diǎn)，負(fù)載抗生素的硫酸鈣是用于治療慢性骨髓炎的最有吸引力的可吸收緩釋載體之一，它能夠消除手術(shù)清創(chuàng)后的死腔，在完全降解后可以釋放全部抗生素[5]，并且缺乏細(xì)菌定植基礎(chǔ)。負(fù)載抗生素的硫酸鈣通過(guò)零級(jí)動(dòng)力學(xué)和表層降解方式釋放抗生素。因此，硫酸鈣的抗生素釋放相對(duì)穩(wěn)定、持續(xù)，并長(zhǎng)期處于治療水平，這可以抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。類(lèi)似于負(fù)載抗生素的 PMMA，負(fù)載抗生素的硫酸鈣也具有固有的缺點(diǎn):它不能為骨骼結(jié)構(gòu)提供機(jī)械支撐作用，尤其是隨著硫酸鈣的降解。然而，骨骼結(jié)構(gòu)的機(jī)械穩(wěn)定性在慢性骨髓炎的治療中具有重要意義[6]。由于其不可降解的特性，負(fù)載抗生素的PMMA 可以為骨骼結(jié)構(gòu)提供即時(shí)或持續(xù)的機(jī)械穩(wěn)定作用或有利于維持骨骼結(jié)構(gòu)穩(wěn)定。

萬(wàn)古霉素是對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有效的糖肽類(lèi)抗生素，尤其適用于耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）所致骨髓炎的治療[7-8]。在以往的臨床研究中，與萬(wàn)古霉素PMMA 比較，萬(wàn)古霉素硫酸鈣和萬(wàn)古霉素PMMA構(gòu)成的硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)能更有效地治療慢性骨髓炎[9]。然而，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的抗生素釋放規(guī)律和抗菌性能仍未清楚。因此，本研究的目的是探討萬(wàn)古霉素硫酸鈣和萬(wàn)古霉素PMMA構(gòu)成的硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)的體外抗生素釋放規(guī)律和抗菌性能，并且和含萬(wàn)古霉素的PMMA 進(jìn)行比較。

1 材料與方法

1.1 材料

萬(wàn)古霉素（CAS NO. 1404-93-9; 分子量: 1486; 希臘）。硫酸鈣（Stimulan?kit，Biocomposites 公司，英國(guó)），PMMA（PALACOS?MV，Heraeus 公司，德國(guó)）。金黃色葡萄球菌亞種（CICC?10301，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心）。

1.2 藥物緩釋系統(tǒng)的制備

根據(jù)說(shuō)明書(shū)制備萬(wàn)古霉素硫酸鈣顆粒。將5 cc Stimulan?硫酸鈣粉劑與1 g 萬(wàn)古霉素粉劑在無(wú)菌碗中攪拌混勻，然后加入3 cc 滅菌用水。充分混合直至形成光滑的糊狀物（約30 s）。在所提供的模具中涂上均勻的糊狀物，使糊狀物固化至少15 min，以形成直徑為3.0 mm、高度為3.0 mm 的顆粒（見(jiàn)圖1A）。在完全固化后彎曲模具釋放顆粒。

負(fù)載萬(wàn)古霉素PMMA根據(jù)以下步驟在無(wú)菌條件下制備。將1 小袋40 g PMMA 粉末與2 g 萬(wàn)古霉素粉劑在無(wú)菌碗中混合。將單體液體加入上述混合物中。然后，將糊狀物涂在柔軟的橡膠模具上，制成大小為15.0 mm×15.0 mm×15.0 mm的正方體元件（見(jiàn)圖1B）。在完全固化后彎曲模具釋放正方體元件。非負(fù)載萬(wàn)古霉素PMMA 元件以同樣的方式制備。

通過(guò)電鉆分別在萬(wàn)古霉素PMMA 元件的兩個(gè)正方形側(cè)面淺層內(nèi)制造5 個(gè)直徑為3.0 mm、高度為3.0 mm 的空腔。把萬(wàn)古霉素硫酸鈣顆粒植入PMMA 元件表層的空腔內(nèi)，以制備硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)（見(jiàn)圖1C）。使用環(huán)氧乙烷對(duì)抗生素緩釋系統(tǒng)進(jìn)行滅菌處理。

圖1 A.萬(wàn)古霉素硫酸鈣顆粒;B.萬(wàn)古霉素PMMA;C.硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)

1.3 模擬體液（SBF）的制備

將 NaHCO30.355 g，NaCl 8.035 g，K2HPO43H2O 0.231 g，MgCl26H2O 0.311g，KCl 0.25 g，Tris 6.118 g，Na2SO40.072 g，CaCl20.292 g，1.0 M-HCl 39 mL 溶于 1 000 mL 的蒸餾水制備模擬體液，用酸度計(jì)測(cè)量溶液的pH，用0 ～5 mL 濃度為l M 的HCl 調(diào)節(jié)溶液的pH 為7.4。

1.4 體外抗生素釋放濃度檢測(cè)

通過(guò)高效液相色譜法（HPLC-MS，檢測(cè)下限為3.125 g/mL）建立萬(wàn)古霉素標(biāo)準(zhǔn)曲線。通過(guò)使用具有紫外（UV）檢測(cè)器（322 nm）和柱（mBondapak，C18，10 mm 125A，3.9 mm×300 mm，Waters 公司，英國(guó)）的Agilent HPLC 系統(tǒng)（Agilent 1100）進(jìn)行HPLC 分析。以三乙胺∶乙腈∶四氫呋喃溶液（92∶7∶1）（pH 3.2）為流動(dòng)相，流速為1 mL/min，室溫下在286 nm 處檢測(cè)萬(wàn)古霉素·HCl。本研究中采取的峰面積和色譜法經(jīng)過(guò)線性、靈敏度、精密度、準(zhǔn)確度和特異性確認(rèn)。

將硫酸鈣/ PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)或萬(wàn)古霉素PMMA 的3 個(gè)樣本分別浸入含有10 mL SBF（pH 7.4）的無(wú)菌聚乙烯容器中，溫度為37℃。在樣品浸入SBF 溶液后的不同時(shí)間點(diǎn)（4 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d 和49 d）進(jìn)行全量換液。將洗脫液在 4℃下保存用于進(jìn)行抑菌環(huán)試驗(yàn)。根據(jù)萬(wàn)古霉素的標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過(guò)HPLC 測(cè)定上述不同時(shí)間點(diǎn)樣品洗脫液中的萬(wàn)古霉素濃度。

1.5 細(xì)菌培養(yǎng)和生長(zhǎng)條件

本研究采用的菌種為金黃色葡萄球菌亞種。把細(xì)菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉汁瓊脂（CM0002，中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心），在37℃下培養(yǎng)24 h，然后鑒定為純培養(yǎng)物用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

把生長(zhǎng)狀態(tài)良好的單菌落接種到營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中并培養(yǎng)48 h，然后用營(yíng)養(yǎng)肉湯把細(xì)菌濃度調(diào)整為1×103、1×105、1×108cfu/mL。

1.6 硫酸鈣/PMMA 復(fù)合釋放系統(tǒng)的抑菌環(huán)試驗(yàn)

制備直徑為6 mm 的濾紙盤(pán)，然后用環(huán)氧乙烷滅菌。從血瓊脂平板中選擇3 ～5 個(gè)菌落，孵育24 h。使用上述菌落制備細(xì)菌懸浮液用于接種。然后將細(xì)菌懸浮液的細(xì)菌濃度調(diào)節(jié)至3×108cfu/mL（0.5McFarland）。用無(wú)菌棉簽吸取細(xì)菌懸浮液，并將棉簽中過(guò)量的細(xì)菌懸浮液擠壓在培養(yǎng)管壁上。將棉簽細(xì)菌涂布在整個(gè)M-H 瓊脂平板的表面上，并將平板每次旋轉(zhuǎn) 90°以確保均勻涂布。將不同時(shí)間點(diǎn)（將樣品浸入SBF 后的 4 h、12 h、1 d、2 d、4 d、7 d、14 d、21 d、28 d、35 d、42 d 和49 d）提取全量換液的30 L SBF 洗脫液浸漬直徑為6 mm 的濾紙盤(pán)。將未含萬(wàn)古霉素的PMMA 浸入SBF中，并將提取物用作抑菌環(huán)檢測(cè)的空白對(duì)照。把濾紙置于涂有細(xì)菌的M-H 瓊脂培養(yǎng)皿并在37℃培養(yǎng)24 h。采用游標(biāo)卡尺測(cè)量濾紙盤(pán)周?chē)囊志h(huán)直徑。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

除非另有說(shuō)明，所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。使用SPSS 11.0 軟件進(jìn)行配對(duì) 檢驗(yàn)（當(dāng)數(shù)據(jù)具有相等方差時(shí)）和非參數(shù) 檢驗(yàn)（當(dāng)數(shù)據(jù)具有不等方差時(shí)），并且<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外抗生素釋放試驗(yàn)

如圖2、圖3 所示，為各檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)以及萬(wàn)古霉素PMMA的萬(wàn)古霉素釋放濃度曲線。硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的硫酸鈣在7 周內(nèi)逐漸降解。硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)和萬(wàn)古霉素 PMMA 釋放萬(wàn)古霉素的特征是先快速釋放后緩慢釋放。在硫酸鈣降解期間，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)釋放的萬(wàn)古霉素最大濃度在24 h 檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為754.68 g/mL。萬(wàn)古霉素PMMA 釋放的萬(wàn)古霉素最大濃度在7 d 檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)為57.39 g/mL。在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)釋放的萬(wàn)古霉素濃度均高于 PMMA 萬(wàn)古霉素釋放的萬(wàn)古霉素濃度（<0.05）。

圖2 硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)不同時(shí)間點(diǎn)釋放的萬(wàn)古霉素濃度

圖3 萬(wàn)古霉素PMMA 不同時(shí)間點(diǎn)釋放的萬(wàn)古霉素濃度

2.2 抗菌性能評(píng)價(jià)

表1 顯示在不同時(shí)間點(diǎn)的萬(wàn)古霉素對(duì)M-H 瓊脂平板上細(xì)菌的抑菌環(huán)直徑。在不同時(shí)間點(diǎn)的抑菌環(huán)試驗(yàn)中，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的抑菌環(huán)直徑均大于萬(wàn)古霉素PMMA 的抑菌環(huán)直徑（見(jiàn)圖4）。在該實(shí)驗(yàn)中，未觀察到非負(fù)載萬(wàn)古霉素PMMA 出現(xiàn)抑菌環(huán)。

表1 不同釋放時(shí)間點(diǎn)的萬(wàn)古霉素對(duì)M-H瓊脂平板上細(xì)菌的抑菌環(huán)試驗(yàn)（mm）

圖4 不同時(shí)間點(diǎn)的抑菌環(huán)（mm）:A.萬(wàn)古霉素PMMA;B.硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)

3 討論

在以往包括臨床研究在內(nèi)的體外和體內(nèi)研究中，比較了各種形式的硫酸鈣和 PMMA，以及其他負(fù)載抗生素的局部緩釋系統(tǒng)的抗生素緩釋和抗菌作用。然而，很少有研究報(bào)道由萬(wàn)古霉素硫酸鈣和萬(wàn)古霉素PMMA構(gòu)成的硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)的抗生素釋放和抗菌性能。因此，本研究探討了由萬(wàn)古霉素硫酸鈣和萬(wàn)古霉素 PMMA 組成的硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的抗菌素釋放規(guī)律和抗菌作用，并與萬(wàn)古霉素PMMA 相比較。

與抗生素PMMA 比較，由萬(wàn)古霉素硫酸鈣和萬(wàn)古霉素PMMA組成的硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)可能具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，或者它可以發(fā)揮協(xié)同抗菌作用。

首先，與抗生素 PMMA 相比，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的萬(wàn)古霉素釋放更多并且在研究期間獲得了持久有效的抗生素濃度。負(fù)載抗生素的PMMA 最常用于作為局部抗生素緩釋系統(tǒng)治療慢性骨髓炎，并且傳統(tǒng)上用于骨科相關(guān)感染的預(yù)防和治療。負(fù)載抗生素的PMMA 可以直接在感染部位釋放抗生素而提高局部的抗生素濃度。但是，PMMA 骨水泥中抗生素的釋放呈現(xiàn)為早期由表層釋放抗生素引起的短期爆發(fā)性釋放[10]，隨后持續(xù)釋放低于治療濃度水平的藥物，并且呈現(xiàn)為抗生素的部分釋放（～10%），這可能導(dǎo)致感染和細(xì)菌生物膜的形成而不能提供有效的抗菌效果[11-12]。由于抗生素 PMMA 的這些缺點(diǎn)，它已經(jīng)引發(fā)對(duì) PMMA 替代品的研究，以便在感染局部能夠獲得更持久和更高濃度的抗生素。與抗生素PMMA 比較，可生物降解的抗生素硫酸鈣在萬(wàn)古霉素釋放方面表現(xiàn)更好，并且抗生素能完全從硫酸鈣中釋放出來(lái)?？股亓蛩徕}的體外釋放動(dòng)力學(xué)表現(xiàn)出緩慢持續(xù)和局部有效釋放。這確保防止抗生素耐藥性的出現(xiàn)，抗生素耐藥性是由于在治療濃度下緩慢的殘留藥物釋放導(dǎo)致的。在本研究中，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的硫酸鈣在7 周內(nèi)逐漸降解，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)的萬(wàn)古霉素釋放濃度均遠(yuǎn)高于抗生素PMMA 的萬(wàn)古霉素釋放濃度（<0.05）。這可能與硫酸鈣的可吸收性質(zhì)和逐漸降解特性有關(guān)。此外，通過(guò)在PMMA 表層嵌入硫酸鈣顆粒能夠保證其可以完全降解及釋放抗生素。

其次，與抗生素PMMA 相比，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)能表現(xiàn)出更好的體外抗菌作用，從體外的抑菌環(huán)試驗(yàn)結(jié)果可以看出，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都能更有效抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.05）?？股?PMMA 被認(rèn)為是治療慢性骨髓炎的標(biāo)準(zhǔn)手段之一，但它有其自身的缺點(diǎn)，主要是它呈現(xiàn)為抗生素爆發(fā)式釋放和低于治療水平的釋放動(dòng)力學(xué)特征，特別是在釋放的抗生素濃度隨時(shí)間下降的時(shí)候[13]。當(dāng)PMMA的抗生素釋放水平低于最小抑制濃度時(shí)，PMMA 載體本身可能作為感染的潛在基礎(chǔ)，并且可以給細(xì)菌的定植和生物膜的形成提供有利條件。細(xì)菌生物膜有利于細(xì)菌生長(zhǎng)[14]，并且能抵抗宿主的免疫攻擊[15]，這可能會(huì)引起慢性感染的發(fā)展和復(fù)發(fā)。將萬(wàn)古霉素硫酸鈣顆粒植入PMMA 的表層可以實(shí)現(xiàn)并維持在預(yù)期的時(shí)間內(nèi)保留所需的抗生素水平而產(chǎn)生更有效的抗菌作用。

最后，硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)可能可以產(chǎn)生協(xié)同作用。由于其固有的不可生物降解特性，萬(wàn)古霉素 PMMA可長(zhǎng)時(shí)間消除外科清創(chuàng)術(shù)后的空腔并提供結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用，這可能有利于骨髓炎的治療和控制后的骨重建?？股亓蛩徕}可以提供有效的局部抗生素濃度[16]，但它也有自身的缺點(diǎn)。硫酸鈣的吸收可以在體內(nèi)快速發(fā)生，并且材料的機(jī)械強(qiáng)度會(huì)隨著降解而迅速喪失，因而不能提供有效的機(jī)械結(jié)構(gòu)支撐和保持骨骼結(jié)構(gòu)完整的作用。在硫酸鈣/PMMA 復(fù)合緩釋系統(tǒng)治療骨髓炎的時(shí)候，隨著硫酸鈣顆粒的降解在感染局部能夠達(dá)到更高水平和更持續(xù)有效的抗菌素濃度。然后，PMMA在提供局部抗生素的同時(shí)可提供結(jié)構(gòu)支撐作用強(qiáng)度和保持骨缺損區(qū)的結(jié)構(gòu)完整性。

在本研究中，與萬(wàn)古霉素PMMA 比較，硫酸鈣/PMMA復(fù)合緩釋系統(tǒng)在檢測(cè)的各個(gè)時(shí)間點(diǎn)都能夠釋放更高濃度的抗生素（<0.05）, 并且在體外可更有效地抑制細(xì)菌生長(zhǎng)（<0.05）。對(duì)該系統(tǒng)進(jìn)一步研究將有利于其在控制骨科感染中的應(yīng)用。