平喘湯對哮喘小鼠模型NLRP3炎癥小體活化的影響

昝杰彧 孫劍玥 徐亞娜 付艷緹 解玉

摘要 目的：探究平喘湯對小鼠支氣管氣道炎性反應的抑制作用，及其作用機制是否與NLRP3炎癥小體活化的調控相關。方法：將6～8周齡C57BL/6雄性小鼠38只隨機分為空白對照組、哮喘模型組、低劑量平喘湯組（15 g/kg）、中等劑量平喘湯組（30 g/kg）、高劑量平喘湯組（60 g/kg）及陽性藥物（地塞米松）對照組。采用腹腔注射及滴鼻吸入卵蛋白致敏法制備小鼠支氣管哮喘模型。除陽性對照組予地塞米松腹腔給藥外，余各組均予對應藥物灌胃，連續(xù)4周。末次給藥后，觀察小鼠一般情況，行為學評分（打噴嚏、抓鼻次數(shù)，呼吸急促程度），小鼠肺泡灌洗液中細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞及巨噬細胞計數(shù)，肺泡灌洗液炎性反應因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表達，肺組織NLRP3炎癥小體及其下游靶向炎性反應因子IL-1β及IL-18表達情況。結果：平喘湯可有效減少哮喘小鼠行為學評分，降低肺泡灌洗液細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性細胞、淋巴細胞及巨噬細胞計數(shù)，下調肺泡灌洗液炎性反應因子IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1表達，抑制肺組織NLRP3炎癥小體、IL-1β及IL-18 mRNA和蛋白表達情況。結論：平喘湯可通過抑制NLRP3炎癥小體活化介導的氣道炎性反應進而減輕哮喘呼吸道癥狀。

關鍵詞 平喘湯;哮喘;氣道炎性反應;NLRP3炎癥小體;IL-1β;IL-18

Effects of Pingchuan Decoction on NLRP3 Inflammasome Activation Induced by Asthma in Mice

ZAN Jieyu，SUN Jianyue，XU Yana，F(xiàn)U Yanti，XIE Yu

（Department of Pediatrics，Putuo Hospital，Shanghai University of Traditional Chinese Medicine，Shanghai 200062，China）

Abstract Objective：To explore the inhibitory effect of Pingchuan Decoction on bronchial airway inflammation in mice，and whether its mechanism is related to the regulation of NLRP3 inflammasome activation.Methods：A total of 38 C57BL/6 male mice aged 6-8 weeks were randomly divided into a blank control group，an asthma model group，a low-dose Pingchuan Decoction group（15 g/kg），and a medium-dose Pingchuan Decoction group（30 g/kg），a high-dose Pingchuan Decoction group（60 g/kg）and a positive drug（dexamethasone）and a control group.A mouse bronchial asthma model was prepared by intraperitoneal injection and intranasal inhalation of egg protein sensitization method.Except for the positive control group who was given dexamethasone intraperitoneally，the other groups were given the corresponding drugs by gavage for 4 consecutive weeks.After the last administration，the general condition of the mice，behavioral scores（number of sneezing，scratching，and degree of shortness of breath），the total number of cells in the mouse alveolar lavage fluid，neutrophils，eosinophils，lymphocytes and Macrophage count，expression of inflammatory factors IL-1β，IL-6，TNF-α and MCP-1 in alveolar lavage fluid，expression of NLRP3 inflammasome and its downstream target inflammatory factors IL-1β and IL-18 in lung tissue were observed.Results：Pingchuan Decoction can effectively reduce the behavioral scores of asthmatic mice，reduce the total number of alveolar lavage fluid cells，neutrophils，eosinophils，lymphocytes and macrophages，and down-regulate the inflammatory factors IL-1β and IL in the alveolar lavage fluid-6，TNF-α and MCP-1 expression，inhibit the expression of NLRP3 inflammasome，IL-1β and IL-18 mRNA and protein in lung tissue.Conclusion：Pingchuan Decoction can reduce the respiratory tract symptoms of asthma by inhibiting the airway inflammation mediated by the activation of NLRP3 inflammasomes.

Keywords Pingchuan Decoction; Asthma; Airway inflammation; NLRP3 inflammasome; IL-1β; IL-18

中圖分類號：R242;R285.5文獻標識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2020.23.018

近10年來由于環(huán)境及人類生活方式的巨大改變，兒童支氣管哮喘（簡稱哮喘）發(fā)病率呈逐年上升趨勢。研究報道，我國城市兒童哮喘的發(fā)病率達3%，個別地區(qū)甚而高達4.2%[1]。因此，哮喘已經成為我國威脅兒童健康的嚴重社會和公共衛(wèi)生問題。目前，盡管哮喘的發(fā)病機制尚未闡明清楚，但研究表明多種炎性反應細胞參與的氣道慢性炎癥在哮喘的發(fā)生、發(fā)展過程中起著核心作用，可導致氣道黏膜損傷、氣道高反應性及氣道重塑[2]。值得注意的是，隨著近年來對炎性反應機制研究的不斷深入，現(xiàn)已明確炎癥小體在啟動細胞炎癥級聯(lián)反應和活化各種炎性反應因子中起著至關重要作用[3]。炎性小體由Tschopp教授于2002年首次發(fā)現(xiàn)，指含有NOD樣受體家族成員蛋白如NLRP1、NLRP3、NLRC4和AIM2等形成的蛋白復合體[3]。其中，NLRP3炎癥小體研究最為廣泛，其由NLRP3、ASC和pro-caspase-1組成的蛋白復合體，其激活后可通過活化caspase-1進而剪切加工IL-1β和IL-18前體，生成IL-1β和IL-18成熟體，發(fā)揮致炎作用[4]。新近研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體在兒童哮喘中發(fā)揮重要作用[5]。平喘湯是邵氏肺科傳人夏以琳教授在張仲景的“三拗湯”的基礎上擬定而成，配合宣肺、平喘等藥物加減而成。已有臨床研究表明，平喘湯對患兒哮喘有顯著療效[6-8]，但目前報道多基于其療效觀察，其作用機制尚不清楚;且各研究報道中平喘湯配方成分及比例不同，療效亦存在差異。本文擬通過構建OVA小鼠哮喘模型，觀察本院自擬平喘湯對哮喘小鼠NLRP3炎癥小體及其介導的氣道炎癥級聯(lián)反應的抑制作用，并在此基礎上深入探討該藥的分子作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 SPF級6～8周齡健康C57BL/6雄性小鼠，體質量20～24 g，購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司。小鼠飼養(yǎng)于本院動物房，飼養(yǎng)環(huán)境：溫度（23±2）℃，濕度40%～70%，12 h/12 h晝夜交替。本研究中對小鼠采取的所有實驗操作皆嚴格遵循上海中醫(yī)藥大學動物倫理委員會制定的準則下進行。實驗小鼠自購入起，適應性飼養(yǎng)1周之后用于實驗。

1.1.2 藥物 本院自擬平喘湯每劑由炙麻黃5 g、杏仁6 g、生甘草6 g、黃芩6 g、蟬蛻6 g、地龍6 g、辛夷6 g、射干6 g、蘇梗9 g、桃仁6 g、柴胡6 g、魚腥草9 g組成。藥物均由上海中醫(yī)藥大學附屬普陀醫(yī)院中藥房提供，口服液由上海中醫(yī)藥大學化學教研室制劑，藥物濃度為2 g（生藥）/mL，密封后儲存于4 ℃冰箱備用。地塞米松注射液（山東魯抗辰欣藥業(yè)有限公司，國藥準字H37021967）。

1.1.3 試劑與儀器 卵蛋白（Sigma-Aldrich公司，美國，批號：A5503-1G）;IL-1β ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國，貨號：SLB50）;IL-6 ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國，貨號：SM6000B）;TNF-α ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國，貨號：PDTA00D）;MCP-1 ELISA試劑盒（R&D systems公司，美國，貨號：DY479-05）;IL-18 ELISA試劑盒（MBL公司，日本，貨號：7625）;NLRP3一抗抗體（Abcam公司，美國，貨號：ab4207）;ASC一抗抗體（Cell signaling Technology公司，美國，貨號：67824）;caspase-1一抗抗體（美國Abcam公司，貨號：ab2012）;β-actin一抗抗體（美國Abcam公司，貨號：ab227387）;羊抗兔二抗抗體（杭州華安生物公司，貨號：HA1014）;羊抗鼠二抗抗體（杭州華安生物公司，貨號：HA1015）;多功能酶標儀（BioTek公司，美國，型號：SynergyHTX/2型）;成像分析系統(tǒng)（Bio-Rad公司，美國，型號：Gel Doc EZ型）;PCR擴增儀（Bio-Rad公司，美國，型號：Thermal Cycler S1000TM型）;熒光定量PCR儀（ABI公司，美國，型號：7900HT型）;倒置顯微鏡（Leica公司，德國，型號：DMi8型）。

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 將38只小鼠隨機分成6組：1）空白對照組（n=6）;2）哮喘模型組（n=8）;3）低劑量給藥組（平喘湯，15 g/kg，n=6）;4）中等劑量給藥組（平喘湯，30 g/kg，n=6）;5）高劑量給藥組（平喘湯，60 g/kg，n=6）;6）陽性對照組（地塞米松，1 mg/kg，n=6）。參考文獻方法[9]，將小鼠在第1、15天腹腔注射OVA混懸液0.2 mL致敏，第15天經鼻腔滴注濃度為2 mg/mL OVA 50 μL激發(fā)，第26、27及28天鼻腔內滴注1 mg/mL OVA 50 μL再次激發(fā)。空白組以等量生理鹽水替代。

1.2.2 給藥方法 各組皆從鼻腔滴注激發(fā)階段第1天起每天給藥，其中空白組及哮喘模型組予等劑量生理鹽水灌胃。各組灌胃或腹腔注射均在激發(fā)前1 h進行。末次給藥24 h后測定相關指標。給藥劑量參照實驗動物和人臨床用藥劑量換算公式：dB=dA*RB/RAx3√WA3√WB[10]。

1.2.3 檢測指標與方法 行為學評分：參考文獻[11]，自OVA末次鼻腔滴注激發(fā)后觀察20 min，記分法記錄各組小鼠打噴嚏、抓鼻次數(shù)及哮喘呼吸嚴重程度。記分方法如下：無噴嚏為0分，<4個為1分，4～10個為2分，>11個為3分;無抓鼻為0分，輕度抓鼻為1分，頻繁抓鼻為2分，抓鼻不止為3分;無喘息為0分，呼吸急促為1分，明顯喘息為2分，喘息致死為3分。

標本收集：腹腔注射10%水合氯醛麻醉小鼠，仰臥位固定，75%乙醇消毒小鼠頸、胸部，剪刀打開小鼠胸腔及游離頸部氣管后，絲線結扎右主支氣管，注射器注入0.6 mL預冷PBS溶液灌洗支氣管肺泡共3次，4 ℃下以3 000 r/min轉速離心15 min，離心半徑9.9 cm，取上清為BALF，細胞沉渣用于細胞涂片。取左肺，置于4%多聚甲醛內固定保存。取右肺，置于-80 ℃保存。

BALF中細胞計數(shù)：BALF離心后細胞沉渣用0.2 mLPBS重懸制備細胞涂片，經Diff-Quick染色法，在光學顯微鏡下進行各種類型細胞計數(shù)。

BALF中IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量：依據(jù)ELISA試劑盒說明書步驟，用酶標儀檢測BALF的OD450 nm值，并繪制標準曲線，計算IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1濃度。

RT-PCR檢測：采用Trizol試劑提取肺組織總RNA，使用酶標儀測定總RNA濃度，去除肺組織樣本中基因組DNA后逆轉錄以合成cDNA。引物設計見表1。微量分光光度計測量cDNA純度及濃度后，ABI 7500型熒光定量PCR儀檢測待測基因及內參β-actin擴增各循環(huán)熒光信號，計算其△Ct值及相對于空白組的相對值。

Western Blot檢測：采用蛋白裂解液提取小鼠右肺組織總蛋白，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取20 μg組織蛋白依次行電泳，轉膜，封閉，接著分別加入NLRP3（1∶1 000）、ASC（1∶500）、caspase-1（1∶1 000）及內參β-actin（1∶5 000）一抗4 ℃過夜。常規(guī)洗膜后加入相應二抗（1∶5 000）室溫下孵育。TBST洗膜三次后使用ECL免疫印跡化學發(fā)光底物暗室中顯影。利用美國Quantility One軟件半定量分析蛋白含量。

免疫組化檢測：取4%多聚甲醛固定的左肺依次進行脫水、浸蠟、包埋、切片，將切片置于60 ℃烤箱內熔蠟后，行脫蠟、脫水、抗原修復步驟，接著分別加入NLRP3（1∶500）、ASC（1∶200）及caspase-1（1∶200）一抗和對應二抗孵育。采用DAB染色及蘇木精復染后，常規(guī)脫水、封片并在光學顯微鏡下觀察。免疫組化結果評分標準參考文獻[12]：0分：無陽性染色;1分：低密度陽性染色;2分：中等密度陽性染色;3分：高密度陽性染色;4分：超高密度陽性染色。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析，其中計數(shù)資料以（%）表示，采用χ2檢驗，計量資料以（±s）表示，采用t檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 小鼠行為學改變 空白組小鼠一般情況可，精神狀態(tài)良好，無明顯異常。模型組小鼠皆出現(xiàn)不同程度煩躁不安，易驚，部分出現(xiàn)腹式呼吸、大小便失禁，打噴嚏、抓鼻次數(shù)增加，呼吸急促程度加深，相較于空白組行為學評分比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.01）。不同劑量給藥組及陽性對照組小鼠行為學評分相較于模型組皆明顯下降（P<0.01）。中等劑量及高劑量給藥組小鼠行為學評分相較于低劑量給藥組小鼠顯著降低（P<0.05），但此兩者間比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見圖1。

2.2 肺泡灌洗液細胞分類計數(shù) 各組小鼠肺泡灌洗液細胞分類計數(shù)結果發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性細胞、淋巴細胞及巨噬細胞計數(shù)較空白組小鼠顯著升高（P<0.01）。與模型組小鼠比較，除低劑量組小鼠中性粒細胞計數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義外，余各觀察組小鼠細胞總數(shù)、中性粒細胞、嗜酸性細胞、淋巴細胞及巨噬細胞計數(shù)均顯著降低（P<0.05）。中等劑量組小鼠細胞總數(shù)及嗜酸性細胞計數(shù)較高劑量組小鼠降低，且存在統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2?；谝陨蠈嶒灲Y果，中等劑量平喘湯將被用于后續(xù)藥物炎性反應抑制的機制研究。

2.3 肺泡灌洗液炎性反應因子表達 模型組小鼠肺泡灌洗液IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量較空白組小鼠顯著升高（P<0.01）。與模型組小鼠比較，給藥組及陽性對照組小鼠IL-1β、IL-6、TNF-α及MCP-1含量明顯下降（P<0.05）。見圖2。

2.4 肺組織NLRP3炎癥小體表達 與空白組比較，模型組小鼠肺組織NLRP3、ASC、pro-caspase-1及caspase-1 mRNA及蛋白表達水平升高（P<0.01）。見圖3A。給予平喘湯或地塞米松后，NLRP3、ASC、pro-caspase-1及caspase-1 mRNA及蛋白表達水平顯著下降（P<0.05）。見圖3B。免疫組化染色結果進一步表明，平喘湯可降低哮喘小鼠NLRP3、ASC及caspase-1表達水平（P<0.01）。見圖4。

2.5 肺組織IL-1β及IL-18表達 模型組小鼠肺組織NLRP3炎癥小體下游活性炎性反應因子IL-1β及IL-18 mRNA較空白組小鼠明顯上升（P<0.01）。與模型組小鼠比較，給藥組及陽性對照組小鼠IL-1β及IL-18蛋白表達顯著下降（P<0.05）。見圖5。

3 討論

氣道慢性炎癥是哮喘的重要特征，包括多種炎性細胞參與，如中性粒細胞、淋巴細胞、嗜酸性粒細胞和巨噬細胞等，這些炎性細胞可產生及活化各種炎性反應因子，如IL-1β、IL-6、IL-18、IFN-β、TNF-α和嗜酸性細胞趨化因子等，進而發(fā)揮促炎效果。本研究通過構建OVA致敏小鼠模型，首次證實我院自擬平喘湯對哮喘的治療作用;進一步分子機制研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體介導的氣道炎性反應在平喘湯發(fā)揮哮喘治療作用中有著重要作用。

目前，臨床上針對患兒哮喘常用的抗炎藥，如糖皮質激素、白三烯受體拮抗藥等，雖能短期內控制氣道炎性反應，緩解癥狀，但長期用藥可導致免疫功能低下、骨質疏松等不良反應[13]。因此，臨床急需尋找安全、有效、經濟且不良反應小的哮喘治療藥物方案。中醫(yī)藥大多為天然植物，其相對價廉，不良反應小，可作為理想選擇。本院自擬平喘湯是邵氏肺科傳人夏以琳教授在張仲景的“三拗湯”的基礎上擬定而成，以炙麻黃、蟬蛻宣肺解痙平喘;杏仁、地龍宣降肺氣、解痙止咳平喘;黃芩清熱潤肺;辛夷祛風通竅;射干、蘇梗溫肺下氣、化痰止咳等，調和諸藥。具有宣降肺氣，理氣祛痰，止咳平喘之功效。前期研究發(fā)現(xiàn)，平喘湯可降低哮喘患兒及動物模型炎性反應因子IL-17、IL-33及TNF-α表達水平，減輕氣道炎性反應癥狀[14]。本研究通過動物實驗進一步發(fā)現(xiàn)，平喘湯可有效降低哮喘后細胞總數(shù)計數(shù)，抑制中性粒細胞、嗜酸性細胞、淋巴細胞及巨噬細胞聚集，下調BALF中炎性反應因子IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1及IL-18表達。結合前期研究，這些結果提示平喘湯可以通過抑制炎性反應，緩解哮喘癥狀。本實驗結果同時指出平喘湯能夠有效降低哮喘小鼠行為學評分，減少打噴嚏、抓鼻次數(shù)，緩解呼吸急促程度，提示平喘湯可顯著改善哮喘臨床癥狀，提高患兒生命質量[15]。

前期研究報道，NLRP3炎癥小體作為固有免疫及適應性免疫系統(tǒng)中的重要成分，在哮喘氣道慢性炎癥的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮著至關重要的作用，其可從上游觸發(fā)及調節(jié)氣道炎性反應，參與氣道高反應性和重塑過程[16-17]。NLRP3炎癥小體由NLRP3、接頭蛋白ASC和caspase-1組成，當細胞受到各種有害刺激后，一方面，NLRP3通過與ASC相互作用，激活核因子-κB（NF-κB），促進炎性反應因子前體（pro-IL-1β、pro-IL-18）或炎性反應因子（如IL-6、TNF-α、MCP-1等）表達。另一方面，NLRP3與ASC結合后能夠招募pro-caspase-1即caspase-1前體，形成蛋白復合體，生成具有生物學活性的成熟體caspase-1，后者可剪切炎性反應因子前體pro-IL-1β及pro-IL-18，使其活化為具有促炎活性的成熟體炎性反應因子IL-1β及IL-18。由此可見，NLRP3炎癥小體的活化是啟動炎癥級聯(lián)反應和造成炎性反應損傷的核心環(huán)節(jié)。IL-1β是一種促進和放大炎性反應的細胞因子，能夠招募淋巴細胞、中性粒細胞及巨噬細胞等免疫細胞聚集，刺激嗜酸性粒細胞活化，誘導NF-κB炎性通路激活，促進IL-6、TNF-α及MCP-1生成，進而加劇氣道慢性炎癥[18]。IL-18能夠調節(jié)Th1/Tc1極化，且可通過T細胞促進Th2細胞炎性反應因子，如IL-4、IL-5、IL-9和IL-13等釋放，從而加劇肺部局部炎性反應，造成氣道高反應性[19]。Li R等[20]研究發(fā)現(xiàn)，哮喘后NLRP3炎癥小體活化，其介導生成的IL-1β和IL-18可明顯觸發(fā)氣道炎性反應，其表達與哮喘嚴重程度密切相關。相反，抑制哮喘后NLRP3炎癥小體活化能夠有效減輕哮喘嚴重程度，減輕氣道炎性反應，降低氣道高反應性[5，21]。本研究亦發(fā)現(xiàn)NLRP3炎癥小體在哮喘肺組織中激活，其可有效觸發(fā)局部炎性反應，加劇哮喘嚴重程度;但給予本院自擬平喘湯治療后，肺組織NLRP3炎癥小體表達及活性受到明顯抑制，其所介導的炎性反應亦顯著降低，證實平喘湯對哮喘的治療作用是通過抑制NLRP3炎癥小體介導的炎癥級聯(lián)反應實現(xiàn)的。

值得注意的是，雖然平喘湯可顯著降低氣道炎性反應，但NLRP3炎癥小體及其下游靶向炎性反應因子仍明顯高于空白組，說明平喘藥不能短期內從根本上逆轉哮喘后氣道炎性反應的病理生理學改變，這也是中醫(yī)學強調哮喘患兒需長期同本（補肺健脾益腎）治療的重要原由。此外，與徐增梅等[22]研究結果不同，我們發(fā)現(xiàn)平喘湯對哮喘的療效低于地塞米松，這可能與動物模型和藥方配比不同有關。

綜上所述，平喘湯可通過抑制NLRP3炎癥小體活化所介導的炎癥級聯(lián)反應，減輕氣道慢性炎癥，緩解哮喘呼吸道癥狀，改善預后。本研究在國家大力發(fā)展中醫(yī)藥和民族醫(yī)藥事業(yè)的背景下，以兒科臨床需要為出發(fā)點，探析經驗藥方的作用及其分子機制，為患兒哮喘的臨床治療提供理論依據(jù)和意見參考。

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（2019-11-04收稿 責任編輯：徐穎）