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      miR-3662在膽囊癌組織中的表達及對膽囊癌細胞增殖的影響

      2020-06-24 01:47:56蔡煒龍余勝汪偉民樓能
      浙江醫(yī)學 2020年8期
      關(guān)鍵詞:膽囊癌孔板靶點

      蔡煒龍 余勝 汪偉民 樓能

      膽囊癌是膽道系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一[1-2]。由于缺乏早期臨床表現(xiàn),膽囊癌患者確診時往往已是中晚期,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移發(fā)生率高,失去根治性手術(shù)機會,預(yù)后差[3]。因此,尋求新的膽囊癌診療靶點尤為重要。miRNA是一類非編碼小RNA分子,幾乎參與了細胞生命周期的全過程,可作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子調(diào)控靶基因的表達[4-6]。目前有研究表明,miR-3662在急性白血病、黑色素瘤及肝癌等惡性腫瘤中異常表達,并在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[7-9]。本研究擬通過檢測miR-3662在人膽囊癌組織中的表達水平,并觀察其對人膽囊癌細胞增殖能力的影響,從而探討miR-3662作為膽囊癌新的治療靶點的可能性,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

      1 材料和方法

      1.1 主要材料和試劑 30對人膽囊癌組織及其癌旁組織標本源自2015年至2019年本院普外科接受手術(shù)治療、并經(jīng)術(shù)后病理證實為原發(fā)性膽囊癌的30例患者;SPF級BALB/c雄性裸鼠8只,4~6周,體重(25.67±3.47)g,購于中國科學院上海動物實驗中心。人膽囊癌細胞株GBC-SD和SGC-996由中國科學院上海生命研究院細胞資源中心提供,DMEM培養(yǎng)基和FBS購于美國Gibco公司,miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實時熒光定量PCR(qRTPCR)試劑盒購于大連Takara公司,miR-NC和miR-3662購于上海拓然生物科技有限公司,脂質(zhì)體2000(Lipofectamine 2000)購于美國Invitroen公司,CCK-8試劑盒、結(jié)晶紫購于上海碧云天生物科技有限公司。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準。

      1.2 實驗方法

      1.2.1 人膽囊癌組織及其癌旁組織中miR-3662相對表達量檢測 采用qRT-PCR法。研磨膽囊癌組織及其癌旁組織,加入Trizol提取組織或細胞的總RNA,檢測RNA的濃度和純度;按miRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書將組織 RNA按照 37℃、60min,85℃、5min的程序反轉(zhuǎn)成miRNA,用qRT-PCR試劑盒進行組織樣本RNA中miR-3662相對表達量的檢測,其相對表達量采用2-△△Ct法計算。

      1.2.2 細胞分組、培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人膽囊癌細胞株GBCSD和SGC-996在含有10%DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞進行實驗。將細胞分為miR-3662組和miR-NC組,其中miR-3662組細胞轉(zhuǎn)染miR-3662,miR-NC細胞轉(zhuǎn)染miR-NC。分別將GBC-SD和SGC-996鋪于6孔板中,24h后根據(jù)試劑盒說明書,采用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染兩組細胞,每6孔板內(nèi)轉(zhuǎn)染50nmol miRNA,轉(zhuǎn)染6h后,更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);轉(zhuǎn)染48h后收集細胞進行后續(xù)實驗。提取細胞RNA后,采用qRT-PCR法檢測兩組細胞中miR-3662的相對表達量,每次實驗重復(fù)3次,取平均值。

      1.2.3 兩組細胞增殖能力檢測 采用CCK-8實驗。將轉(zhuǎn)染48h后的細胞進行胰酶消化、離心、重懸后計數(shù),將細胞接種于96孔板中,每孔1×103個細胞,每組設(shè)置4個復(fù)孔,放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。分別于6h、1、2、3、4、5d 加入 20%CCK-8,37℃避光培養(yǎng) 2h 后,使用酶標儀檢測450nm處吸光度(A)值來表示細胞增殖能力,并根據(jù)A450值繪制細胞生長曲線,上述實驗重復(fù)3次,取平均值。

      1.2.4 平板克隆形成實驗 將轉(zhuǎn)染48h后的細胞進行胰酶消化、離心、重懸后計數(shù),將兩組細胞分別接種于6孔板中,每孔500個細胞,每組設(shè)置3個復(fù)孔,放入5%CO2培養(yǎng)箱中37℃恒溫培養(yǎng)。持續(xù)7d,每3d更換一次培養(yǎng)基。7d后棄培養(yǎng)基,每孔加入1ml 4%多聚甲醛固定后以結(jié)晶紫染色。將培養(yǎng)皿放置在倒置顯微鏡下,觀察細胞集落形成數(shù),拍照并采用Image J軟件進行計數(shù)。

      1.2.5 裸鼠皮下移植瘤實驗 將8只裸鼠按隨機數(shù)字表法分為實驗組和陰性對照組,每組4只,其中實驗組裸鼠接種miR-3662組細胞,陰性對照組裸鼠接種miR-NC組細胞。將轉(zhuǎn)染48h后的細胞進行胰酶消化、離心、重懸后計數(shù),分別配置成濃度為1×107個/ml的細胞懸液,用1ml的注射器沿裸鼠右側(cè)肋弓接種至腋下,之后每周觀察裸鼠皮下移植瘤生長情況并進行測量記錄。接種4周后,采用頸椎脫位法處死裸鼠。將腫瘤完整剝離下來后,兩組裸鼠的腫瘤放在一起進行拍照,將瘤體進行稱重,記錄并統(tǒng)計。

      1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示,組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

      2 結(jié)果

      2.1 人膽囊癌組織及其癌旁組織中miR-3662相對表達量比較 miR-3662在人膽囊癌組織中的相對表達量0.06±0.02,明顯低于癌旁組織的 0.16±0.05,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

      2.2 兩組細胞中miR-3662相對表達量比較 miR-3662組GBC-SD和SGC-996的miR-3662的相對表達量較miR-NC組均明顯上調(diào),差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05)。見表 1。

      表1 兩組細胞中miR-3662的相對表達量比較

      2.3 兩組細胞增殖能力比較 加入CCK-8后第5天時,與miR-NC組相比,miR-3662組細胞A450值明顯為小,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖1。

      2.4 兩組細胞集落形成數(shù)比較 miR-3662組GBC-SD和SGC-996的集落形成數(shù)較miR-NC組均明顯減少,差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.05),見圖2(插頁)、表2。

      圖1 兩組細胞A450值比較(與miR-NC組比較,*P<0.05)

      表2 兩組集落形成數(shù)比較(個)

      2.5 兩組細胞移植瘤質(zhì)量比較 實驗組裸鼠皮下移植瘤質(zhì)量(0.057±0.012)g,較陰性對照組(0.210±0.042)g明顯減少,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

      圖3 兩組移植瘤體積比較

      3 討論

      近年來,膽囊癌的發(fā)病率逐年升高,中位生存時間僅有不到20個月,預(yù)后極差[10-11]。盡管目前膽囊癌在化學治療、靶向治療和免疫治療等藥物研究上有所突破,但由于腫瘤耐藥性等原因,治療效果仍較差。因此,迫切需要新的膽囊癌分子靶點應(yīng)用于臨床。目前已有超過1 400多條miRNA被發(fā)現(xiàn)在惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要的生物學功能,可通過類似癌基因、抑癌基因或其他方式調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡和遷移等活動[12-13]。miRNA在膽囊癌中也發(fā)揮著重要作用,研究表明,大量miRNA 如 miR-29c-5p、miR-143-3p、miR-139-5p 等在膽囊癌中差異表達,調(diào)控膽囊癌的發(fā)生、發(fā)展[14-16]。miR-3662在多種惡性腫瘤中表達失調(diào),Powrózek等[17]比較了90例肺癌患者的血漿樣本與85例健康對照組的血漿樣本,發(fā)現(xiàn)miR-3662在肺癌患者中的表達明顯上調(diào),有望成為潛在的肺癌生物標志物。Maharry等[18]報道發(fā)現(xiàn)miR-3662的表達豐度越高,造血組細胞(尤其是紅系譜系)中的集落形成數(shù)越多,而急性髓樣白血病細胞中并無miR-3662的表達,且miR-3662過表達具有抗白血病的作用。Chen等[9]發(fā)現(xiàn)miR-3662在肝癌細胞中表達下調(diào),通過作用于下游靶基因HIF-1α調(diào)控瓦博格效應(yīng)和肝癌的進展。這些結(jié)果均表明miR-3662可能成為新的惡性腫瘤標志物和藥物靶點。

      本研究筆者檢測了30對膽囊癌組織和癌旁組織中miR-3662的相對表達量,發(fā)現(xiàn)相比于癌旁組織,miR-3662在膽囊癌組織中的相對表達量明顯下調(diào)。在膽囊癌細胞中轉(zhuǎn)染miR-3662后,qRT-PCR顯示GBC-SD和SGC-996細胞中miR-3662的相對表達量明顯上調(diào)。通過CCK-8細胞增殖實驗和平板克隆形成實驗發(fā)現(xiàn),過表達miR-3662后GBC-SD和SGC-996細胞的體外增殖能力明顯下調(diào)。裸鼠皮下移植瘤實驗結(jié)果顯示miR-3662過表達后移植瘤體積明顯縮小,且質(zhì)量更小,提示miR-3662可在體內(nèi)抑制膽囊癌細胞的增殖能力。本研究表明,miR-3662可能作為抑癌miRNA在膽囊癌中發(fā)揮生物學功能,體內(nèi)外實驗均表明miR-3662可以抑制膽囊癌細胞的增殖能力,提示其可為膽囊癌的新的分子靶點,但其下游調(diào)控的分子及信號通路仍有待進一步研究。

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