閉式少預(yù)充量大鼠深低溫停循環(huán)模型的建立

王立烽 韋冬冬 朱賢 李學(xué)彪 宋江偉 孔敏堅(jiān) 董愛(ài)強(qiáng)

主動(dòng)脈弓手術(shù)死亡率及術(shù)后神經(jīng)并發(fā)癥發(fā)生率高，尤其是主動(dòng)脈瘤破裂及急性主動(dòng)脈夾層等急診手術(shù)，術(shù)中需要施行低溫停循環(huán)操作，期間全身臟器處于缺血、缺氧狀態(tài)，整個(gè)過(guò)程對(duì)機(jī)體造成炎癥反應(yīng)損傷、缺血、缺氧損傷、低溫?fù)p傷、缺血再灌注損傷等[1]。在損傷病理、生理過(guò)程及保護(hù)機(jī)制研究中常需要一種穩(wěn)定的動(dòng)物模型，就大鼠體外循環(huán)及深低溫停循環(huán)模型而言，插管方式、停跳方式、體外循環(huán)流量、升降溫方式、預(yù)充量等各有不同[2-4]。體外循環(huán)管道預(yù)充量直接影響術(shù)中血液稀釋程度，血液稀釋程度與微循環(huán)灌注、凝血功能、術(shù)中輸血、術(shù)后急性腎損傷發(fā)生率相關(guān)[5]。降低管道預(yù)充量，提高術(shù)中紅細(xì)胞壓積（Hct）也是心臟外科體外循環(huán)團(tuán)隊(duì)所不懈追求的。本研究建立閉式少預(yù)充量大鼠深低溫停循環(huán)模型，為研究停循環(huán)臟器損害及保護(hù)提供可靠模型基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 器材及試劑 器材：手術(shù)器械、鼠板、體外循環(huán)臺(tái)、閉式體外循環(huán)管道系統(tǒng)[含變溫器]均購(gòu)自西安西京醫(yī)療用品有限公司；小動(dòng)物膜肺購(gòu)自東莞科威醫(yī)療器械公司；自制儲(chǔ)血室（圖 1）、滾壓泵（LongerPump）、水箱、多導(dǎo)電生理監(jiān)測(cè)儀（PowerLab）、麻醉機(jī)、小動(dòng)物呼吸機(jī)均購(gòu)自上海奧爾科特生物科技公司。試劑：戊巴比妥鈉（5g）購(gòu)自中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；肝素（12 500U/支）購(gòu)自常州千紅生化制藥公司；萬(wàn)汶（500ml）購(gòu)自北京費(fèi)森尤斯卡比醫(yī)藥公司；七氟烷（120ml）購(gòu)自上海恒瑞醫(yī)藥有限公司；5%碳酸氫鈉（NaHCO3）（250ml）購(gòu)自江蘇正大天晴藥業(yè)公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 12周齡SPF級(jí)SD雄性大鼠20只，體重（412.8±20.8）g，均購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2017-0005。

1.3 實(shí)驗(yàn)步驟

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組 將20只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分成A、B、C、D 4組，每組5只。A組：體外循環(huán)降溫至24℃后復(fù)溫；B組：降溫至24℃后靜脈放血至心臟停跳，30min后復(fù)溫復(fù)跳；C組：降溫至18℃后放血停跳，30min后復(fù)溫復(fù)跳；D組降溫至18℃后停跳，1h后復(fù)溫復(fù)跳。

1.3.2 手術(shù)及穿刺 實(shí)驗(yàn)大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉1.5ml，充分麻醉后行氣管插管，并接空氣呼吸機(jī)按5ml/min潮氣量60次/min維持（由于實(shí)驗(yàn)大鼠體重相近，麻醉劑量及呼吸機(jī)參數(shù)不按體重作調(diào)整）。分別在大鼠左腹股溝及股部、尾部、右頸部消毒備皮，在大鼠左耳后頸部剪開(kāi)一小口，鈍性分離皮下得一腔道，用于置入溫度傳感器監(jiān)測(cè)溫度。輕柔地分離出左股淺動(dòng)脈、尾動(dòng)脈、右頸外靜脈，血管兩端用外科絲線(xiàn)掛線(xiàn)備用。用肝素化24G動(dòng)脈穿刺針穿刺股淺動(dòng)脈，注入1ml 500IU/ml肝素，股淺動(dòng)脈用于連接動(dòng)脈監(jiān)測(cè)。尾動(dòng)脈用肝素化20G動(dòng)脈穿刺針穿刺，穿刺完成后采集動(dòng)脈血?dú)庖詼y(cè)術(shù)前血?dú)?。結(jié)扎右頸外靜脈遠(yuǎn)心端，近心一側(cè)剪開(kāi)一口，置入導(dǎo)絲，導(dǎo)絲送入下腔靜脈后沿導(dǎo)絲置入自制48孔靜脈引流管（圖2），將引流管置入適當(dāng)深度后退出導(dǎo)絲，套線(xiàn)扎緊靜脈壁防止出血。手術(shù)操作總出血量控制在0.5ml左右。穿刺完成后將大鼠置于體外循環(huán)臺(tái)，連接溫度監(jiān)測(cè)及動(dòng)脈監(jiān)測(cè)，同時(shí)氧氣瓶連接麻醉機(jī)對(duì)呼吸機(jī)供氧，通過(guò)調(diào)節(jié)氣麻深度控制大鼠轉(zhuǎn)機(jī)前血壓穩(wěn)定。

圖1 儲(chǔ)血室

圖2 48孔靜脈引流管

1.3.3 管道預(yù)充排氣 本實(shí)驗(yàn)采用閉式少預(yù)充量管道，總預(yù)充量7～8ml，實(shí)物圖及示意圖見(jiàn)圖3、圖4。管道用萬(wàn)汶預(yù)充，并用250IU肝素肝素化管道，敲擊管道壁充分排氣，管道靜脈端接頸靜脈插管，動(dòng)脈端接尾動(dòng)脈插管。

圖3 大鼠體外循環(huán)實(shí)物圖

圖4 體外循環(huán)管道示意圖

1.3.4 轉(zhuǎn)機(jī)及降溫 管道連接完成，生命體征監(jiān)測(cè)無(wú)明顯異常，膜肺進(jìn)氣口接純氧（氣體流量約14ml/min），滾壓泵小流量開(kāi)始轉(zhuǎn)機(jī)，此時(shí)可見(jiàn)大鼠血壓迅速下降，隨后慢慢回升，緩慢增加轉(zhuǎn)機(jī)流量（至35～45ml/min），改呼吸機(jī)頻率為40次/min，待循環(huán)穩(wěn)定后開(kāi)啟水箱開(kāi)始降溫。由于C、D組需降溫至18℃，為控制循環(huán)時(shí)間盡量相同使用冰袋及加熱毯協(xié)助升降溫，A、B組單純使用變溫器控制溫度。

1.3.5 停跳 降溫至18℃過(guò)程中大鼠心率明顯減慢，在40次/min左右，但都不能自行停跳，本實(shí)驗(yàn)采用引空靜脈血方法加快心臟停跳，心臟停跳后開(kāi)始計(jì)時(shí)，B、C組停跳30min，D組停跳1h。停跳期間通過(guò)間斷性物理降溫方式防止大鼠體溫回升。

1.3.6 復(fù)溫及復(fù)蘇 A組大鼠體溫降至24℃后即開(kāi)始復(fù)溫，B、C、D組大鼠結(jié)束低溫停循環(huán)后開(kāi)始復(fù)溫。復(fù)溫階段首先通過(guò)低流量轉(zhuǎn)機(jī)將停循環(huán)期間引出的靜脈血回輸回體外循環(huán)管道系統(tǒng)，緩慢增加轉(zhuǎn)機(jī)流量，并改呼吸機(jī)頻率為50次/min。B、D組大鼠經(jīng)驗(yàn)性補(bǔ)堿1ml，C組經(jīng)驗(yàn)性補(bǔ)堿0.5ml，心臟復(fù)跳時(shí)抽取動(dòng)脈血?dú)?，用以調(diào)節(jié)酸堿及血?dú)庵?。大鼠?fù)溫后期均有明顯或不明顯的血壓下降過(guò)程，過(guò)程中需謹(jǐn)慎補(bǔ)液，僅需將血壓維持在最低可耐受血壓即可。待大鼠血?dú)馑釅A穩(wěn)定，氣體分壓穩(wěn)定，乳酸呈下降趨勢(shì)后拔除動(dòng)靜脈插管，大鼠于變溫毯呼吸機(jī)支持下等待戊巴比妥鈉代謝失效，麻醉復(fù)蘇后拔除氣管插管，在溫暖富氧環(huán)境下充分復(fù)蘇，回籠飼養(yǎng)過(guò)夜。術(shù)后24h觀察大鼠存活及一般活動(dòng)情況，用過(guò)量麻醉法處死大鼠并取腹主動(dòng)脈血檢測(cè)血?dú)庵怠?/p>

1.3.7 觀測(cè)指標(biāo) 觀察并統(tǒng)計(jì)術(shù)后24h大鼠存活及一般活動(dòng)情況；術(shù)中通過(guò)多導(dǎo)電生理儀記錄平均血壓及心率作為血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)；術(shù)中及術(shù)后24h血?dú)庵捣治?，包括pH、Hct、乳酸及血糖。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠術(shù)后24h存活情況及一般活動(dòng)情況 術(shù)后24h觀察各組大鼠，B組大鼠死亡1只，具體死因不詳，其余大鼠全部存活。術(shù)后各組大鼠均能正常活動(dòng)、攀爬，A組大鼠整體活動(dòng)量偏少，4組大鼠均無(wú)明顯一側(cè)腦梗死典型行為學(xué)表現(xiàn)。

2.2 4組大鼠血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)比較 4組大鼠血壓及心率隨降溫明顯下降，隨升溫而回升。平均血壓在復(fù)溫末期均有一個(gè)下降峰存在，A、B組出現(xiàn)早，C、D組出現(xiàn)晚，在整個(gè)過(guò)程中平均血壓均能維持在60mmHg以上。C組血流動(dòng)力學(xué)更平穩(wěn)，B、D組平均血壓下降峰明顯，此外D組復(fù)溫末期心率（450.0±15.8）次/min明顯快于基礎(chǔ)心率（354.0±35.8）次/min，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 5-8。

2.3 4組血?dú)鈖H、Hct比較 4組大鼠在體外循環(huán)期間pH組間比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。術(shù)后24h，A組Hct均明顯低于B、C、D組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其余時(shí)間4組Hct比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。見(jiàn)表1。

2.4 4組血?dú)馊樗?、血糖結(jié)果比較 與術(shù)前比較，B、C、D組復(fù)溫初、停機(jī)前乳酸、血糖均明顯升高（均P＜0.05）；復(fù)溫初時(shí)，B、C組乳酸、血糖比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），D、C組乳酸、血糖比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均 P＜0.05）；停機(jī)前時(shí)，D 組乳酸值均高于 A、B、C組（均P＜0.05），B組乳酸值均高于 A、C組（均P＜0.05），B、D組血糖均明顯高于A、C組（均P＜0.05），C組血糖明顯高于A組（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

圖5 降溫階段平均血壓趨勢(shì)圖

圖6 升溫階段平均血壓趨勢(shì)圖

圖7 降溫階段平均心率趨勢(shì)圖

圖8 升溫階段平均心率趨勢(shì)圖

表1 4組大鼠血?dú)鈖H、Hct比較

表2 4組大鼠血?dú)馊樗帷⒀侵档谋容^（mmol/L）

3 討論

低溫停循環(huán)模型是個(gè)較難構(gòu)建的模型，其中體外循環(huán)過(guò)度血液稀釋、術(shù)中氣體栓塞、液體負(fù)荷過(guò)大等都是造成實(shí)驗(yàn)動(dòng)物死亡率過(guò)高的原因。目前國(guó)外文獻(xiàn)中大鼠深低溫停循環(huán)時(shí)間最長(zhǎng)是60min[6]，此外目前臨床上，中低溫停循環(huán)聯(lián)合順行性腦灌注被認(rèn)為是最佳的腦保護(hù)策略，中低溫停循環(huán)也有進(jìn)一步的臨床研究意義。本文創(chuàng)新性使用閉式少預(yù)充量管道，解決了模型構(gòu)建中血液過(guò)度稀釋及氣體栓塞的問(wèn)題。關(guān)于專(zhuān)利管道詳細(xì)內(nèi)容及優(yōu)勢(shì)見(jiàn)專(zhuān)利授權(quán)[7]。

乳酸在一定程度上可反映組織缺血、缺氧水平，經(jīng)歷停循環(huán)損傷的B、C、D組乳酸值均明顯升高，此外B組明顯高于C組，提示隨著停循環(huán)溫度升高，大鼠受缺血、缺氧損傷明顯加重。D組乳酸值明顯高于C組，提示隨著停循環(huán)時(shí)間延長(zhǎng)，大鼠受缺血、缺氧損傷亦明顯加重。術(shù)后24h各組大鼠乳酸值均恢復(fù)至正常水平，提示大鼠術(shù)后內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，無(wú)缺血、缺氧表現(xiàn)，模型具有良好的穩(wěn)定性和高存活率。

血糖值在一定程度上反映大鼠應(yīng)對(duì)損傷的應(yīng)激水平，隨著手術(shù)進(jìn)程推進(jìn)，大鼠血糖值呈持續(xù)升高狀態(tài)，其中B、D組明顯高于C組，同樣表明延長(zhǎng)停循環(huán)時(shí)間及升高停循環(huán)體溫時(shí)大鼠的損傷應(yīng)激更明顯。C組高于A組，提示深低溫停循環(huán)30min在血?dú)鈨?nèi)環(huán)境方面大鼠已經(jīng)有了缺血、缺氧損傷表現(xiàn)。

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果來(lái)看，本套閉式少量預(yù)充管道系統(tǒng)在體外循環(huán)實(shí)驗(yàn)及深低溫、中低溫停循環(huán)實(shí)驗(yàn)中都有高成功率及可重復(fù)性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果和預(yù)期略有差異，A組術(shù)后24h Hct明顯低于預(yù)期，也低于其它實(shí)驗(yàn)組，由此表現(xiàn)為大鼠活動(dòng)能力也低于實(shí)驗(yàn)組，考慮連續(xù)的體外循環(huán)及降升溫對(duì)紅細(xì)胞損傷較大，在設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)時(shí)需要重視如何控制體外循環(huán)時(shí)間。18℃深低溫停循環(huán)60min大鼠術(shù)后24h活動(dòng)能力良好，表現(xiàn)活躍，四肢尚且協(xié)調(diào)，深低溫停循環(huán)1h尚未達(dá)到大鼠耐受極限，后續(xù)將延長(zhǎng)深低溫停循環(huán)時(shí)間，探究極限狀態(tài)下器官損傷情況[8]。此外體外循環(huán)對(duì)紅細(xì)胞損傷也不容忽視，調(diào)整泵管及動(dòng)脈穿刺針型號(hào)，優(yōu)化外界輔助升降溫方法以減少術(shù)中紅細(xì)胞破壞，這對(duì)提高極限狀態(tài)下存活率或許有幫助。

實(shí)驗(yàn)中大鼠體外循環(huán)系統(tǒng)采用純氧供氣，通過(guò)使用空氧混合氣體可降低術(shù)中氧分壓，用于研究高氧灌注和低氧灌注相關(guān)研究[9-10]。體外循環(huán)階段大鼠Hct能維持在30%左右，可做血液稀釋方面研究[11]。實(shí)驗(yàn)中可見(jiàn)18℃深低溫停循環(huán)60min大鼠乳酸下降明顯偏慢，可做肝臟損傷方面研究[12]，術(shù)后24h解剖大鼠取材見(jiàn)十二指腸后空腸韌性變差，術(shù)后大鼠糞便性狀改變，可做腸道方面研究。升溫末期深低溫停循環(huán)大鼠血壓均有明顯或不明顯的下降趨勢(shì)，可做心臟及微循環(huán)方面研究。降低中樞代謝，延長(zhǎng)腦耐受缺血、缺氧時(shí)間作為深低溫初衷，腦保護(hù)也是研究主要內(nèi)容。逆行性自體血回輸可進(jìn)一步提升術(shù)中Hct，可進(jìn)行相關(guān)血液稀釋及微循環(huán)方面研究[13]。本實(shí)驗(yàn)已取腦、心、肺、腸、肝、腎、動(dòng)脈血等標(biāo)本，將后續(xù)進(jìn)行深低溫停循環(huán)術(shù)后24h標(biāo)本蛋白免疫印跡及組織切片研究。