GRP78在不同亞型宮頸癌細(xì)胞株中表達(dá)情況及對順鉑敏感性影響*

張冉浠，周莉，陸安偉，秦娟

550004 貴陽，貴州醫(yī)科大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院(張冉浠、秦娟)；550004 貴陽, 貴陽市婦幼保健院 婦科腫瘤科(周莉、秦娟)；518000 廣東 深圳，南方醫(yī)科大學(xué)深圳醫(yī)院 婦科(陸安偉)

宮頸癌是全球女性死亡的主要原因之一。順鉑通過損傷細(xì)胞DNA用于宮頸癌的化療。但順鉑化療的敏感性問題亟需解決。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的一個主要應(yīng)激介導(dǎo)蛋白，既往認(rèn)為GRP78表達(dá)水平與宮頸癌發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[1]。已有研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)(endoplasmic reticulum stress,ERS)可降低P53突變肺癌細(xì)胞對順鉑的化療耐受[2]。目前已知GRP78在卵巢腫瘤細(xì)胞中有抗順鉑耐藥作用[3]。但GRP78與人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)相關(guān)宮頸癌細(xì)胞對順鉑敏感性之間的關(guān)系尚不明確。本試驗擬探討不同HPV亞型宮頸癌細(xì)胞GRP78表達(dá)水平的差異；通過不同濃度順鉑處理后，對比內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活劑衣霉素聯(lián)合順鉑處理后，宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性及GRP78的表達(dá)水平變化，了解ERS與宮頸癌順鉑耐藥間的關(guān)系，尋找宮頸癌治療的新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 人宮頸癌細(xì)胞株 SiHa(HPV16+)、HeLa(HPV18+)及C33a(HPV-)購自上海中喬新舟生物科技有限公司。

1.1.2 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、GRP78(兔抗人)一抗、二抗：羊抗兔IgG、順鉑、衣霉素、細(xì)胞全蛋白抽提試劑盒、聚氰基丙烯酸正丁酯(butyleyanoacrylate,BCA)蛋白定量試劑盒。

1.2 主要方法

1.2.1 細(xì)胞株培養(yǎng) 培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及1%雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)液中，于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞密度約為5×105個/mL時進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.2 免疫組織化學(xué)法 取3種細(xì)胞的細(xì)胞爬片各一張，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，加入4%多聚甲醛、一抗(GRP78抗體，稀釋倍數(shù)1∶100)，濕盒、4℃孵育過夜。二抗處理后二氨基聯(lián)苯胺顯色、蘇木素復(fù)染。顯微鏡下觀察：陽性染色細(xì)胞漿或胞核呈黃色，用IPP 6.0軟件進(jìn)行陽性著色細(xì)胞計數(shù)。陽性細(xì)胞表達(dá)率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%[4]。

1.2.3 藥物處理 將HeLa、SiHa、C33a細(xì)胞株各自分為3組，空白組僅用緩沖液處理，A組為不同濃度順鉑處理(1、10、20 μmol/L)；B組為不同濃度順鉑(1、10、20 μmol/L)+衣霉素處理(衣霉素組采用二甲基亞砜培養(yǎng)基稀釋，濃度為1 mg/L)。

1.2.4 四甲基偶氮唑藍(lán)(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)比色法 調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1×106個/mL，接種于96孔板，每個樣品設(shè)5～8個平行孔，分為對照組、A組(順鉑組)、B組(順鉑+衣霉素組)：每組給予藥物處理(濃度梯度如上述)，培養(yǎng)24 h后[5]，每孔加入5 mg/mL的MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)、離心，吸取上清液，后測定吸光度值。同時設(shè)立空白組，計算細(xì)胞抑制率。

1.2.5 Western blot 提取細(xì)胞內(nèi)蛋白后用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白濃度。聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至聚偏二氟乙烯膜；以5%脫脂牛奶封閉2h后孵育一抗，于4℃孵育過夜；吐溫磷酸鹽緩沖液洗滌3次后孵育二抗，于室溫孵育2h，Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)獲取圖像。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間相互比較先進(jìn)行單因素方差齊性檢驗，方差齊性時用杜凱氏方法，方差不齊時用非參數(shù)檢驗的兩獨立樣本秩和檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 宮頸癌細(xì)胞中GRP78表達(dá)

SiHa細(xì)胞呈多角形，細(xì)胞漿和細(xì)胞核內(nèi)均出現(xiàn)棕黃色顆粒，染色為強陽性。HeLa細(xì)胞形態(tài)與Siha類似，胞漿表現(xiàn)為強陽性，但胞核染色較SiHa細(xì)胞稍弱。C33a細(xì)胞較小，外形呈圓形且細(xì)胞核較大，C33a細(xì)胞中的染色較弱，胞漿為弱陽性(圖1)。3類宮頸癌細(xì)胞中SiHa細(xì)胞中的GRP78蛋白陽性率表達(dá)最高(P<0.01)；與Siha、HeLa細(xì)胞相比較，C33a細(xì)胞中的蛋白陽性表達(dá)率最低(表1，圖1)。

圖1 GRP78在3種細(xì)胞株中的表達(dá)

Figure 1. Expression of GRP78 in Three Cell Lines

A1, B1, C1: Positive immunoreactivity in SiHa, HeLa, C33a (as indicated by the arrow, ×400); a1, b1, c1: Positive immunoreactivity in SiHa, HeLa, C33a (as indicated by the arrow, ×200).

GRP78: Glucose regulated protein 78.

表1 在不同HPV 亞型宮頸癌細(xì)胞GRP78陽性細(xì)胞數(shù)及率的比較(F=315.41，P<0.001;χ2=11.454,P=0.003)

Tab 1. Comparison of positive cell number and rate of Grp78 in cervical cancer cells with different HPV subtypes(F=315.41，P<0.001)

CellsubtypesNumberofpositivecells(x±s)LSD-tPPositiverate(%)χ2PHPV16(+)Siha181±4.1314.60<0.00199.15%11.340.001HPV18(+)HeLa157±4.3825.67<0.00186.45%4.350.039HPV(-)C33A124±2.5268.52%

P: HPV16(+)SihavsHPV(-)C33a; HPV18(+)HeLavsHPV(-)C33a

HPV: Human papilloma virus.

2.2 MTT檢測3組細(xì)胞抑制率

A(順鉑組)、B組(順鉑+衣霉素)隨著順鉑濃度增加(1μmol/L、10μmol/L、20μmol/L)：HeLa、C33a細(xì)胞抑制率均呈增高趨勢，SiHa細(xì)胞抑制率于順鉑濃度為10μmol/L(33.50%)時稍有降低，但整體呈上升趨勢；A組中：HeLa細(xì)胞抑制率(53.40%、58.80%、74.30%)明顯高于SiHa細(xì)胞(33.90%、33.50%、45.10%)、C33a細(xì)胞(6.20%、20.40%、30.60%)(P<0.05);B組中C33a細(xì)胞抑制率分別為16.20%、23.50%、39.40%，較A組有所升高，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);HeLa細(xì)胞抑制率分別為：71.20%、81.50%、94.10%；SiHa細(xì)胞抑制率分別為：43.80%、57.70%、62.30%。與A組相比，B組中HeLa和SiHa兩種宮頸癌細(xì)胞抑制率較A組升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(圖2)。

圖2 A組(順鉑組)及B組(衣霉素+順鉑組)宮頸癌細(xì)胞增殖抑制情況

Figure 2. Proliferation of Cervical Cells Inhibited by Cisplatin or Tunicamycin plus Cisplatin at Different Concentrations

2.3 不同濃度順鉑及衣霉素對三種亞型宮頸癌細(xì)胞GRP78表達(dá)水平的影響

A(順鉑組)、B組(順鉑+衣霉素組)中GRP78在3種細(xì)胞中均隨著順鉑藥物濃度增加而表達(dá)水平升高。相同順鉑濃度下，B組SiHa、HeLa細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平較A組明顯升高(P<0.01)；C33a細(xì)胞在順鉑濃度為1μmol/L、20μmol/L時GRP78蛋白表達(dá)水平較A組升高(P<0.05)，在順鉑濃度10 μmol/L時GRP78蛋白表達(dá)水平較A組稍低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3、4)。

圖3 各組細(xì)胞GRP78的表達(dá)(以GAPDH為內(nèi)參)

Figure 3. Expression of GRP78 in Each Group (GAPDH as Internal Reference)

1: Normal control; 2-4: Treated with cisplatin alone (1, 10, 20 μmol/L); 5-7: Treated with tunicamycin + cisplatin (1, 10, 20 μmol/L).

GRP78: Glucose regulated protein 78; GAPDH: Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase.

圖4 A組(順鉑組)、B組(衣霉素+順鉑組)中3種細(xì)胞GRP78蛋白表達(dá)水平比較

Figure 4. Expression of GRP78 in Three Kinds of Cells Treated with Cisplatin or Tunicamycin plus Cisplatin

3 討 論

3.1 宮頸癌與GRP78蛋白關(guān)系

宮頸癌的發(fā)生、進(jìn)展與高危型HPV持續(xù)感染有關(guān)，中國大陸女性中常見HPV感染類型包括HPV16、18、52、33等,不同地區(qū)型別分布和感染率不同[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞常見細(xì)胞器，腫瘤細(xì)胞中基因突變和基因重排導(dǎo)致錯誤折疊蛋白的累積，進(jìn)而引起ERS[7]。GRP78是ERS的主要調(diào)節(jié)器。研究表明，GRP78與腫瘤增生、侵襲等信號通路有關(guān)。GRP78在許多腫瘤組織中高表達(dá)[8]。研究發(fā)現(xiàn)宮頸癌組織中，GRP78在高危型HPV感染陽性組織中表達(dá)率顯著高于低危型HPV及HPV陰性組織[9]。也有研究指出HPV16、18宮頸癌患者ERS相關(guān)蛋白表達(dá)水平(GRP78等)明顯高于HPV-6和HPV陰性宮頸癌患者[10]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)GRP78蛋白在3種宮頸癌細(xì)胞中均有表達(dá)，而HeLa、SiHa細(xì)胞株中的蛋白表達(dá)明顯高于C33a細(xì)胞株，且SiHa細(xì)胞的表達(dá)水平最高，故認(rèn)為GRP78表達(dá)與宮頸癌不同HPV亞型相關(guān)，ERS可能參與宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展。

3.2 順鉑敏感性與GRP78蛋白關(guān)系

順鉑是通過損傷細(xì)胞DNA發(fā)揮抗腫瘤作用的化療藥物，作用機制在于其可與DNA構(gòu)成嘌呤間產(chǎn)生交聯(lián)作用，影響DNA修復(fù)，引起DNA損傷，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞凋亡。順鉑引起細(xì)胞凋亡的途徑，與細(xì)胞應(yīng)激導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶9前體活化，形成凋亡體復(fù)合體有關(guān)，但一旦發(fā)生凋亡不足則會導(dǎo)致順鉑耐藥[11]。

Cubillos-Ruiz等[12]發(fā)現(xiàn)原位癌中ERS通常與高級別癌變、化療耐藥相關(guān)。GRP78廣泛用作ERS的生物標(biāo)記。近期發(fā)現(xiàn)GRP78與癌癥發(fā)生、進(jìn)展及順鉑耐藥密切相關(guān)。有研究指出GRP78高表達(dá)與腫瘤侵襲性增加、預(yù)后有關(guān)，GRP78蛋白通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞凋亡通路，改變腫瘤細(xì)胞對抗腫瘤藥物的反應(yīng)[13]，Luo等[14]發(fā)現(xiàn)GRP78與宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性有關(guān)，然而GRP78在化療耐受方面的作用與腫瘤類型有關(guān)[15]。

本研究通過不同濃度順鉑、順鉑聯(lián)合衣霉素處理3種亞型宮頸癌細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)3種宮頸癌細(xì)胞株對順鉑都存在濃度依賴性反應(yīng)。不同亞型宮頸癌細(xì)胞對順鉑敏感性不同，其中HeLa、Siha細(xì)胞抑制率較高，C33a細(xì)胞抑制率最低，從而推測HPV(-)細(xì)胞對順鉑的敏感性低于HPV16/18亞型宮頸癌細(xì)胞。Xu等[16]研究認(rèn)為順鉑可以使HeLa細(xì)胞的GRP78、轉(zhuǎn)錄因子C/EBP同源蛋白等ERS相關(guān)蛋白表達(dá)增加，且乳胞素可以通過引起GRP78表達(dá)水平上調(diào)增強順鉑對HeLa細(xì)胞的細(xì)胞毒性。本實驗結(jié)果提示HPV陰性細(xì)胞(C33a)較HPV高危陽性細(xì)胞(HeLa、SiHa細(xì)胞)，GRP78蛋白呈現(xiàn)低表達(dá)，并且順鉑作用后的細(xì)胞抑制率最低。故推測這種低表達(dá)與HPV陰性宮頸癌細(xì)胞對順鉑敏感性降低有關(guān)，GRP78表達(dá)趨勢可能與宮頸癌細(xì)胞對順鉑的敏感性相關(guān)。

3.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活劑增加順鉑敏感性

衣霉素是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激活劑，通過引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Ahmad等[17]發(fā)現(xiàn)A549肺癌細(xì)胞在用衣霉素處理后，通過上調(diào)GRP78蛋白表達(dá)，激活應(yīng)激活化蛋白激酶通路和核因子激活的B細(xì)胞的k-輕鏈增強通路，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，使A549肺癌細(xì)胞對順鉑呈高度敏感性。本項研究發(fā)現(xiàn)與順鉑組相比，聯(lián)合衣霉素組GRP78表達(dá)水平明顯增加，且抑制細(xì)胞增殖能力增強，其中HeLa、SiHa細(xì)胞抑制率升高有統(tǒng)計學(xué)意義，由此推測衣霉素聯(lián)合順鉑可以顯著抑制宮頸癌HeLa細(xì)胞、SiHa細(xì)胞增殖，其原因可能與激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白的表達(dá)，減少脫氧核糖核酸雙鏈斷裂修復(fù)，導(dǎo)致細(xì)胞死亡有關(guān)。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：衣霉素順鉑聯(lián)合作用于宮頸癌細(xì)胞后，GRP78表達(dá)水平均升高，較單獨順鉑作用所介導(dǎo)的細(xì)胞抑制率進(jìn)一步升高，以HeLa細(xì)胞株抑制率上升最明顯。而C33a細(xì)胞在聯(lián)合衣霉素使用后，順鉑對該種細(xì)胞的抑制率無明顯改變。此結(jié)果表明：ERS導(dǎo)致GRP78蛋白一過性升高可增加HPV16/18(+)宮頸癌細(xì)胞株對順鉑的敏感性，而對于HPV陰性宮頸癌細(xì)胞衣霉素并未改善其對順鉑的敏感性。

一些研究認(rèn)為GRP78表達(dá)水平上調(diào)可以增加SPCA1肺癌細(xì)胞、EC9706食管癌細(xì)胞對順鉑化療的敏感性[18-19]。Belfi等[20]也認(rèn)為上調(diào)GRP78表達(dá)水平可以增加直腸癌細(xì)胞株(HCT116、SW480、VACO-8)對包括順鉑在內(nèi)等通過損傷細(xì)胞DNA發(fā)揮作用的腫瘤化療藥物的敏感性。Gaddameedhi等[21]認(rèn)為未折疊蛋白反應(yīng)、GRP78蛋白水平上調(diào)可下調(diào)促進(jìn)DNA修復(fù)的基因，引起線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞死亡，進(jìn)而增加A549肺癌細(xì)胞對順鉑的敏感性。本研究結(jié)果也表明GRP78水平升高會增加宮頸癌細(xì)胞的化療敏感性，衣霉素聯(lián)合順鉑可以增強順鉑的抗腫瘤作用，尤其增強對HPV陽性宮頸癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。因此，推測可能與GRP78蛋白表達(dá)上調(diào)可以活化半胱氨酸蛋白酶有關(guān)。以上研究結(jié)果可以為使用衣霉素增敏順鉑治療宮頸癌提供新的思考方向。

4 結(jié) 論

本文結(jié)果提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能參與宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展；GRP78表達(dá)水平與宮頸癌細(xì)胞順鉑敏感性有關(guān)。宮頸癌HeLa及Siha細(xì)胞可能通過上調(diào)GRP78蛋白來增加對順鉑的化療敏感性，該結(jié)論希望為宮頸癌的治療提供相應(yīng)的理論基礎(chǔ)。

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