一測多評法同時測定復(fù)方玄駒膠囊中7種成分的含量

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院藥學(xué)部，江蘇 南京 210008）

復(fù)方玄駒膠囊由淫羊藿、蛇床子、枸杞子和黑螞蟻4味中藥加工而成，主要用于神疲乏力、精神不振、腰膝酸軟、少腹陰器發(fā)涼、精冷滑泄、肢冷尿頻、性欲低下、功能性勃起功能障礙等腎陽虛證的治療，也可用于改善類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎腎陽不足、風(fēng)寒痹阻證引起的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等癥狀[1]?，F(xiàn)代研究表明復(fù)方玄駒膠囊對腎移植受者勃起功能障礙[2]、慢性前列腺炎[3-4]、早泄[5]、精子頂體酶活性低下[6]等病癥療效顯著，也可用于改善子宮內(nèi)膜薄型不孕癥患者內(nèi)膜容受性[7]。其聯(lián)合胰激肽原酶、來曲唑、他達(dá)拉非、克羅米芬等化藥對畸形精子癥患者精子核蛋白異常[8]、多囊卵巢綜合征[9]、中老年男性繼發(fā)性陰莖勃起功能障礙[10]、腹型肥胖伴勃起功能障礙[11]、男性少弱精[12]等病癥亦有較好的臨床治療效。復(fù)方玄駒膠囊現(xiàn)收載于國家食品藥品監(jiān)督管理總局國家藥品標(biāo)準(zhǔn)WS3-014（Z-014）-2003（Z）-2017，標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)[13-15]中僅對淫羊藿所含淫羊藿苷進(jìn)行了定量研究。中藥制劑由多味中藥材組方而成，每味中藥材含有多種化學(xué)成分，其臨床效果為多種成分共同作用的結(jié)果，單一成分難以全面反映中藥制劑的產(chǎn)品質(zhì)量，多組分控制模式已逐步應(yīng)用于中藥制劑的質(zhì)量評價中。本文采用一測多評法，以歐前胡素為內(nèi)參物，利用中藥各成分間存在的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系，建立淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素與歐前胡素的相對校正因子，實現(xiàn)對復(fù)方玄駒膠囊所含7種主要成分的同時測定，為全面評價復(fù)方玄駒膠囊的產(chǎn)品質(zhì)量提供數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UltiMate 3000型高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾公司）；安捷倫1260型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；AUX120分析天平（日本Shimadzu公司）；CPX8800-C型超聲波振蕩儀（美國Branson公司）。

1.2 試藥

淫羊藿苷對照品（批號：110737-201516，CAS號：489-32-7，含量：94.2 %），寶藿苷I對照品（批號：111852-201603，CAS號：113558-15-9，含量：99.9 %），歐前胡素對照品（批號：110826-201616，CAS號：482-44-0，含量：99.6 %），蛇床子素對照品（批號：110822-201710，CAS號：484-12-8，含量：99.5 %），兒茶素對照品（批號：110877-201604，CAS號：154-23-4，含量：99.2 %），表兒茶素對照品（批號：110878-201703，CAS號：490-46-0，含量：99.7 %，中國食品藥品檢定研究院）；佛手柑內(nèi)酯對照品（批號：PRF8063045，CAS號：484-20-8，含量：99.8 %，成都普瑞法科技開發(fā)有限公司）；復(fù)方玄駒膠囊（規(guī)格：0.42 g/粒，批號：20180706，20190115，20190316，浙江施強(qiáng)制藥有限公司）；乙腈為色譜純（美國Fisher公司），其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 供試品溶液的制備 取復(fù)方玄駒膠囊適量，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50 %甲醇25 ml，稱重，超聲（功率：320 W，頻率：40 kHz）處理30 min，放冷，用50 %甲醇補(bǔ)重，搖勻，過濾，續(xù)濾液用0.45 μm微孔濾膜過濾，備用。

2.1.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素對照品適量，用50 %甲醇制成各對照品儲備液（淫羊藿苷1.414 mg/ml，寶藿苷I0.698 mg/ml，佛手柑內(nèi)酯0.212 mg/ml，歐前胡素1.286 mg/ml，蛇床子素1.804 mg/ml，兒茶素0.372 mg/ml，表兒茶素1.138 mg/ml）；精密吸取各儲備液2.5 ml，置同一50 ml量瓶中，用50 %甲醇稀釋至刻度，搖勻，制成混合對照品溶液（淫羊藿苷70.7 μg/ml，寶藿苷I34.9 μg/ml，佛手柑內(nèi)酯10.6 μg/ml，歐前胡素64.3 μg/ml，蛇床子素90.2 μg/ml，兒茶素18.6 μg/ml，表兒茶素56.9 μg/ml），備用。

2.1.3 陰性對照溶液的制備 按復(fù)方玄駒膠囊的處方工藝，制備缺淫羊藿、缺蛇床子和缺枸杞子的3種陰性樣品，再按2.1.1項下方法制成3種陰性樣品溶液，備用。

2.2 色譜條件

采用Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動相A：乙腈，流動相B：0.5 %醋酸溶液，按表1進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長分別為270 nm[16-18]（0～17.0 min檢測淫羊藿苷和寶藿苷I）、320 nm[18-20]（17.0～28.0 min檢測佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素和蛇床子素）和280 nm[21]（28.0～40.0 min檢測兒茶素和表兒茶素）；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：10 μl。

表1 梯度洗脫程序

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適用性考察 精密吸取混合對照品溶液、復(fù)方玄駒膠囊供試品溶液和3種陰性對照溶液各10μl，按2.2項色譜條件進(jìn)樣檢測，色譜圖見圖1。由圖1可見，色譜圖基線平穩(wěn)，目標(biāo)成分淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素與相鄰峰均能達(dá)到有效分離，分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)按各目標(biāo)成分色譜峰計均大于4000，陰性對照溶液色譜圖中，在與淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素相應(yīng)保留時間處無干擾。

2.3.2 線性與范圍考察 分別精密吸取2.1.2項下對照品儲備液各2.0 ml，置于同一20 ml量瓶中，加50 %甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為混標(biāo)溶液I，再依次精密吸取混標(biāo)溶液I各適量，依次用50 %甲醇稀釋2倍、4倍、8倍、16倍、20倍，制成混標(biāo)溶液II～VI，依次精密吸取混標(biāo)溶液VI～I(xiàn)各適量，進(jìn)樣檢測淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的峰面積，以質(zhì)量濃度（c，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積（A）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表2。

2.3.3 相對校正因子的計算 在標(biāo)準(zhǔn)曲線A=ac+b中，c=（A-b）/a=A/a-b/a，由2.3.2項下各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，a/b值均大于100，b/a值可忽略不計。本文采用斜率校正法，以歐前胡素為內(nèi)參物，按照計算公式fk/s=ak/as（式中ak為內(nèi)參物標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率，as為其他待測成分標(biāo)準(zhǔn)曲線斜率）分別計算淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的相對校正因子。結(jié)果淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的相對校正因子分別為0.7768，1.1331，0.9917，0.6610，0.8829和1.1335。

圖1 對照品溶液、供試品溶液及陰性對照溶液的HPLC色譜圖

表2 7種成分線性關(guān)系和范圍

2.3.4 儀器精密度試驗 精密量取淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素混合對照品溶液適量，按2.2項色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的峰面積，結(jié)果各成分峰面積的RSD分別為0.76 %，0.91 %，1.32 %，0.63 %，0.58 %，1.01 %和0.85 %。

2.3.5 重復(fù)性試驗 取同一批次復(fù)方玄駒膠囊適量，按2.1.1項下方法平行制備供試品溶液6份，再按2.2項色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，并計算得淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素含量的RSD分別為1.25 %，1.44 %，0.52 %，1.37 %，1.14 %，0.63 %和1.20 %。

2.3.6 供試品溶液穩(wěn)定性試驗 取復(fù)方玄駒膠囊樣品，按2.1.1項下方法制備供試品溶液，于0，2，4，6，10，16，24 h依法進(jìn)樣檢測，記錄淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的峰面積，結(jié)果復(fù)方玄駒膠囊供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定，目標(biāo)成分色譜峰峰面積的RSD分別為0.72 %，0.88 %，1.24 %，0.57 %，0.63 %，0.99 %和0.81 %。

2.3.7 加樣回收率試驗 取已知含量的復(fù)方玄駒膠囊樣品，傾出內(nèi)容物，研細(xì)，取9份，每份0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別精密加入加標(biāo)混合對照品溶液（淫羊藿苷0.455 mg/ml，寶藿苷I 0.237 mg/ml，佛手柑內(nèi)酯0.059 mg mg/ml，歐前胡素0.434 mg/ml，蛇床子素0.609 mg/ml，兒茶素0.131 mg/ml，表兒茶素0.366 mg/ml）各1.0，2.0，3.0 ml，再按2.1.1項下方法制備加樣樣品溶液，按2.2項色譜條件依法進(jìn)樣檢測，結(jié)果所測成分淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的平均加樣回收率分分別為98.82 %，97.90 %，96.84 %，99.93 %，98.26 %，97.64 %和99.07 %，RSD分別為0.94 %，1.33 %，1.16 %，0.98 %，1.41 %，1.20 %和1.03 %（n=9）。

2.4 相對校正因子精密度考察

2.4.1 不同儀器和色譜柱對相對校正因子的影響 考察UltiMate3000型和安捷倫1260型高效液相色譜儀兩個品牌儀器和Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Prep-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個品牌色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表3。

表3 不同儀器、不同色譜柱相對校正因子測定結(jié)果

2.4.2 目標(biāo)成分色譜峰的定位 準(zhǔn)確定位各目標(biāo)成分的色譜峰是“一測多評法”應(yīng)用的前提，本文采用相對保留時間法，考察UltiMate3000型和安捷倫1260型高效液相色譜儀兩個品牌儀器和Welchrom-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent Prep-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Diamonsi C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）3個品牌色譜柱對相對保留時間的影響，結(jié)果見表4。

2.5 一測多評法與外標(biāo)法的比較

取3個批次的復(fù)方玄駒膠囊樣品各適量，按2.1.1項下方法每個批次平行制備3份復(fù)方玄駒膠囊樣品溶液，依法進(jìn)樣測定，記錄淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的峰面積，先采用外標(biāo)法計算7種目標(biāo)成分的含量；再按內(nèi)參物歐前胡素實測含量，根據(jù)2.3.3項下建立的相對校正因子計算淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素的含量，結(jié)果一測多評法計算結(jié)果與外標(biāo)法實測結(jié)果無明顯差異[相對平均偏差（RAD）＜2.0 %]，檢測結(jié)果見表5。

3 討論

3.1 目標(biāo)成分的選擇

復(fù)方玄駒膠囊由淫羊藿、蛇床子、枸杞子和黑螞蟻4味中藥加工而成，方中淫羊藿為小檗科植物淫羊藿、箭葉淫羊藿、柔毛淫羊藿或朝鮮淫羊藿的干燥葉，具有補(bǔ)腎陽、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕的功效，淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、寶藿苷I等黃酮類化合物為其主要有效成分，中國藥典2015年版一部以淫羊藿苷和寶藿苷I為其定量測定指標(biāo)；蛇床子為傘形科植物蛇床的干燥成熟果實，主要含香豆素類、揮發(fā)油、色原酮、萜類等化學(xué)成分，其中佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素等香豆素類化合物為其主要有效成分，中國藥典2015年版一部以蛇床子素為其定量測定指標(biāo)；枸杞子為茄科植物寧夏枸杞的干燥成熟果實，兒茶素、表兒茶素、原兒茶醛、咖啡酸等酚酸類成分為其主要成分；黑螞蟻為蟻科動物鼎突多刺蟻或雙齒多刺蟻的干燥體，具有益氣強(qiáng)身、養(yǎng)肝榮筋、補(bǔ)腎驅(qū)寒、活血通絡(luò)的功效，主要含蛋白質(zhì)、氨基酸類成分。本文選取方中淫羊藿所含代表性成分淫羊藿苷、寶藿苷I，蛇床子所含主要成分佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素，枸杞子所含主要成分兒茶素、表兒茶素為定量測定目標(biāo)成分，采用一測多評法，建立復(fù)方玄駒膠囊中7種成分的多指標(biāo)控制模式。

表4 不同儀器、不同色譜柱對相對保留時間的影響

表5 樣品測定結(jié)果（n=3）

3.2 色譜條件的選擇

首先以乙腈-水系統(tǒng)為流動相，試驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)以乙腈-水[17-19]為流動相進(jìn)行分析時，蛇床子素峰拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，同時檢測時間過長，為改善峰形，縮短檢測時間，向水相中加入酸性較弱的醋酸溶液，通過不斷摸索，最終確定以乙腈-0.5 %醋酸水溶液[16,20]為流動相，按2.2項下的流動相比例進(jìn)行梯度洗脫，實現(xiàn)對復(fù)方玄駒膠囊中淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素含量的同時測定。

3.3 供試品提取方法的選擇

實驗中首先對比考察了提取溶劑（50 %甲醇[21]、甲醇[19]、50 %乙醇[16-18]、乙醇[18]）對目標(biāo)成分淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、歐前胡素、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素綜合提取率的影響，結(jié)果50 %甲醇為提取溶劑時效果最佳；在此基礎(chǔ)上，對提取方式（超聲提取[17-20]、加熱回流提取[16]）和提取時間（15，30，60 min）進(jìn)行了對比考察，最終確定采用50 %甲醇超聲提取30 min 作為復(fù)方玄駒膠囊供試品溶液的制備方法。

本研究以歐前胡素為內(nèi)參物，測得淫羊藿苷、寶藿苷I、佛手柑內(nèi)酯、蛇床子素、兒茶素、表兒茶素與歐前胡素的相對校正因子，通過對相對校正因子耐用性的考察和各目標(biāo)成分色譜峰的定位，驗證所建立方法的準(zhǔn)確性和可行性。本文所建立的一測多評法操作便捷，準(zhǔn)確度高，為全面評價復(fù)方玄駒膠囊產(chǎn)品質(zhì)量提供了參考依據(jù)。