正交法優(yōu)選醋制白屈菜最佳炮制工藝

（遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

白屈菜為罌粟科植物白屈菜（Chelidonium majusL.）的干燥全草，主要含白屈菜紅堿等生物堿類化合物[1]?，F(xiàn)代研究表明，其所含的白屈菜紅堿、原阿片堿等屬原鴉片堿類，具有中樞抑制作用，有類似嗎啡樣的鎮(zhèn)痛及催眠作用[2]。目前白屈菜飲片除了簡單的凈制方法外，未見報道其他炮制方法。本課題初步研究結果發(fā)現(xiàn)，利用燜制法炮制的白屈菜在湯劑煎煮過程中，其提取率較高，是生品提取率的近兩倍。且白屈菜具有止痛的作用，中醫(yī)理論認為醋制后能引藥歸肝經(jīng)，并增強止痛作用。同時，現(xiàn)代研究表明，白屈菜當中含大量生物堿，經(jīng)炮制特別是醋制后，能更好地發(fā)揮白屈菜中生物堿類成分的作用。本研究的主要內(nèi)容是以白屈菜中原阿片堿等6種生物堿總量為評價指標，采用正交設計法，優(yōu)選白屈菜的燜法炮制最佳工藝，為白屈菜飲片的進一步炮制研究奠定基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；安捷倫色譜工作站；SF-130B高速粉碎機（上海冠聯(lián)）；AS3120超聲提取器（天津奧特賽恩斯）；CP225D十萬分之一電子天平（Sartorius）；RE5ZCS旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.2 試藥

吉林產(chǎn)白屈菜，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學藥學院王榮祥教授鑒定為罌粟科植物白屈菜（Chelidonium majusL.）的干燥全草；廚邦9度米醋（廣東美味調(diào)味食品有限公司）；白屈菜堿（南京源植物生物科技有限公司，批號YZ180424，含量＞99.9 %）；原阿片堿（批號：20170612，含量：99.5 %），鹽酸黃連堿（批號：20170719，含量：98.2 %），血根堿（批號：20140717，含量：99.6 %），小檗堿（批號：20160907，含量：99.5 %），白屈菜紅堿（批號：20170103，含量：98.1 %，大連美侖生物技術有限公司）；乙腈（色譜純，國藥集團）；鹽酸等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 溶液的配制

2.1.1 對照品溶液的制備 分別取原阿片堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿和白屈菜紅堿對照品，加甲醇配制成濃度分別為0.0160，0.0512，0.0431，0.0218，0.0113，0.0162 mg/ml的混合對照品溶液備用。

2.1.2 供試品溶液的制備 取本品粉末（過三號篩）約2 g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加鹽酸-甲醇（0.5:100）混合溶液40 ml，稱定重量，加熱回流1.5 h，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇（0.5:100）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml，蒸干，殘渣加50 %甲醇使溶解，轉移至10 ml量瓶中，加50 %甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[3]。

2.2 色譜條件[4-5]

色譜柱為中匯達Kromasil ODS-C18分析柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：0.1 %三乙胺（用磷酸調(diào)節(jié)pH值至3.0，A）-乙腈（B）；梯度洗脫條件：0～18 min，24 %B；18～32 min：24 %B→35 %B；檢測波長為274 nm；流速為1 ml/min；柱溫35 ℃；進樣量為20 μl。

2.3 專屬性實驗

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20 μl，按2.2項色譜條件測定，結果對照品的分離度良好，且與供試品中的其他成分不干擾。

圖1 對照品（A）、白屈菜藥材（B）的HPLC圖譜

2.4 線性關系的考察

分別精密吸取含原阿片堿0.80 mg/ml、白屈菜堿1.28 mg/ml、鹽酸黃連堿1.0775 mg/ml、血根堿0.545 mg/ml、小檗堿 0.2825 mg/ml和白屈菜紅堿0.405 mg/ml的混合對照品溶液1.0，2.0，4.0，6.0，8.0，10.0，20.0 ml，置于25 ml量瓶中，以甲醇定容，按2.2項下色譜條件測定色譜峰面積，以對照品進樣量（X，μg）為橫坐標，峰面積值為縱坐標（Y），繪制標準曲線，回歸方程及線性范圍見表1。結果表明6種對照品均具有良好的線性關系。

表1 6種對照品回歸方程及線性范圍

2.5 精密度試驗

精密吸取6種對照品，測定，測得6種對照品的峰面積RSD（n=6）分別是1.04 %，1.02 %，1.14 %，0.66 %，1.20 %，0.55 %，說明方法精密度良好。

2.6 重復性試驗

取樣品，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進樣測定，結果6種對照品含量分別為0.51，4.77，4.71，1.30，0.35，1.01 mg/g，RSD（n=6）分別為1.12 %，1.51 %，0.93 %，1.61 %，1.02 %，1.74 %，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取供試品，按2.2項下色譜條件，于0，2，4，8，12，24 h進樣測定，結果6種對照品的峰面積RSD（n=6）分別為1.59 %，1.85 %，0.63 %，1.04 %，0.80 %，0.92 %，表明樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收試驗

取樣品粉末6份，每份約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入含原阿片堿1.01 mg/ml、白屈菜堿9.71 mg/ml、鹽酸黃連堿9.51 mg/ml、血根堿 2.58 mg/ml、小檗堿0.70 mg/ml和白屈菜紅堿2.04 mg/ml的混合對照品溶液10 ml，按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項色譜條件進行HPLC測定，計算回收率，平均回收率分別為97.5 %，99.4 %，100.8 %，99.7 %，98.9 %和98.6 %，RSD分別為2.41 %，2.41 %，2.32 %，2.33 %，2.01 %和1.81 %，符合相關規(guī)定。

2.9 正交設計及含量測定結果[6-7]

前期研究采用炙法、烘法、蒸法、燜法和煮法對白屈菜進行炮制，結果發(fā)現(xiàn)，燜法總生物堿含量為11.98 mg/g，是5種方法中生物堿含量最高的，接近于生品（12.61 mg/g），于是采用燜法進行正交試驗研究，以醋用量、燜潤時間、烘干時間和烘干溫度為因素，各取3個水平，因素水平見表2；按表3進行正交試驗，因素指標相關圖見圖2。

表2 因素水平表

表3 L9(34)正交設計及含量測定結果

圖2 因素指標相關圖

對表3數(shù)據(jù)進行方差分析，結果見表4。

表4 方差分析表

直觀分析表明，其最佳組合為A3B2C3D1，各因素影響順序為A＞B＞D＞C。方差分析表明，A和B因素差異有統(tǒng)計學意義，加醋量3水平最佳，即醋用量30 %；燜潤時間2水平最佳，即燜潤2 h，C和D因素差異無統(tǒng)計學意義，選擇烘干時間20 h，烘干溫度60 ℃。因素最佳組合為A3B2C3D1，即醋用量30 %，燜潤2 h，60 ℃下烘20 h。

2.10 驗證試驗

稱取白屈菜3份，每份約100 g，分別加30 g米醋拌勻，燜潤2 h，60 ℃下烘20 h。按2.1.2項下方法制備供試品溶液，按2.2項下色譜條件進行HPLC測定。結果平均含量為11.89 mg/g，RSD為1.08 %，表明優(yōu)選出的工藝可靠。

3 結論

本研究所建立白屈菜的HPLC含量測定方法，簡單易行，可用于白屈菜樣品的含量測定。以原阿片堿等6個生物堿成分的總量作為醋制工藝評價指標，具有一定的客觀性。經(jīng)正交試驗優(yōu)選出醋制白屈菜的最佳工藝條件為：醋用量30 %，燜潤2 h，60 ℃下烘20 h。