外源鈣和硫化氫對鎘脅迫下平邑甜茶幼苗根系活性氧代謝和線粒體特性的影響

曹慧，潘利，姜倩倩，鄒巖梅，束懷瑞

(1.濰坊學院 山東省高校生物化學與分子生物學重點實驗室，山東 濰坊 261061；2.濰坊一中，山東 濰坊 261041；3.國家蘋果工程技術研究中心，山東 泰安 271018)

由于工業(yè)“三廢”和生活垃圾的不得當處置，污水灌溉，以及農藥化肥的不合理使用，果園土壤已不同程度受到鎘等重金屬的污染。鎘是毒性很強的重金屬，可對果品安全生產及人類健康構成嚴重威脅[1]。高濃度鎘能夠誘導植物產生大量活性氧(Reactive oxygen species，ROS)，對細胞膜、蛋白和核酸等生物大分子具有破壞作用，嚴重時導致細胞死亡。植物根系中的ROS主要來源于線粒體，反過來線粒體又是ROS作用的靶子，它可提高線粒體膜通透性，引起細胞色素c(Cyt c)釋放；Cyt c是線粒體呼吸鏈上傳遞電子的載體，線粒體Cyt c的流失可直接引起電子傳遞受阻或中斷，刺激線粒體膜通透性進一步開放，從而產生更多的ROS，繼而引發(fā)一系列下游反應，最終導致細胞受損壞死[2]。鎘脅迫使平邑甜茶根系線粒體MTP增大，膜電位(Δψm)和 Cyt c含量下降，H2O2含量升高，最終導致細胞程序性死亡(Programmed cell death，PCD)的發(fā)生[3]。

近幾年，越來越多的研究表明新型內源性氣體信號分子硫化氫(Hydrogen sulfide，H2S) 具有復雜的生物學活性，參與多種生理和病理過程，其在植物中的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。在調節(jié)植物生長發(fā)育方面，H2S可促進種子萌發(fā)[4]，調控保衛(wèi)細胞[5]，增強葉片光合作用[6]，延遲衰老等[7]。在植物抗逆方面，H2S可以通過減小葉片氣孔孔徑，激活抗氧化系統(tǒng)，調控離子通道活性及基因表達等參與植物對鹽堿[8]、重金屬[9]、溫度[10]等逆境脅迫的響應。并且，H2S與ROS、NO、Ca2+和植物激素等信號路徑存在相互作用，共同調控植物生長發(fā)育和逆境脅迫響應過程[11-12]。Ca2+作為植物細胞的第二信使，胞內Ca2+水平改變，轉導多種生理過程。Ca2+/CaM參與H2S介導的煙草懸浮細胞耐熱性的提高[13]，在谷子響應Cr6+脅迫的過程中，Ca2+調控H2S的產生，外源H2S促進Ca2+響應基因的表達，Ca2+作為初始信號與H2S相互作用[12]。

關于H2S對植物Cd脅迫的緩解作用已有一些報道，但多以草本植物或懸浮細胞為研究對象。果樹生長在受鎘污染的土壤中，根系首當其害，但國內外對根系的研究遠不如對地上部的研究廣泛和深入。平邑甜茶(MalushupehensisRehd.)是優(yōu)良的蘋果砧木資源，抗性較強，在生產上具有重要的應用價值[14]。本試驗以平邑甜茶幼苗為材料，探究H2S能否緩解Cd脅迫對平邑甜茶幼苗根系造成的損傷，利用外源Ca2+以及Ca2+螯合劑EGTA、質膜Ca2+通道阻斷劑La3+和鈣調素拮抗劑CPZ，研究了平邑甜茶幼苗活性氧代謝和線粒體特性的變化，以研究證明Ca2+在H2S介導重金屬脅迫信號傳導中的作用，從而為提高果樹抗逆應用研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與處理

精選飽滿、均勻的平邑甜茶種子，用飽和漂白粉溶液消毒15 min，蒸餾水洗凈后浸泡24 h，4 ℃冰箱層積35 d，待種子露白后，播種于12 cm×18 cm營養(yǎng)缽，基質為草炭、珍珠巖和蛭石按照3∶1∶1的比例配制。每缽播種2粒種子，待幼苗長至5～6片真葉，選取整齊一致的幼苗移入Hoagland營養(yǎng)液(pH值6.5)中進行水培，每2 d更換一次營養(yǎng)液。當幼苗生長至12～13片真葉時，用硫酸鎘(CdSO4，200 μmol/L)處理，同時在營養(yǎng)液中加入H2S供體硫氫化鈉(NaHS，購自Sigma公司)或氯化鈣(CaCl2)/鈣抑制劑處理，鈣離子專一螯合劑為EGTA，鈣離子通道阻斷劑為LaCl3或鈣調素拮抗劑為CPZ。

試驗處理為對照CK：正常營養(yǎng)液；T1：200 μmol/L Cd脅迫處理；T2：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS處理；T3：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS+10 mmol/L EGTA處理；T4：200 μmol/L Cd+200 μmol/L NaHS+50 μmol/L LaCl3處理；T5：200 μmol/L Cd+ 200 μmol/L NaHS + 50 μmol/L CPZ處理；T6：200 μmol/L CdSO4+10 mmol/L CaCl2處理。每處理3次重復，處理后第2天取根系進行活性氧代謝和線粒體特性等生理指標測定；處理后第8天取幼苗植株測定株高、莖粗和干鮮質量等生長指標。采用軟件 SPSS和Excel 2010進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析和圖表繪制。

1.2 測定方法

植株生物量測定：株高(莖基部到生長點)用直尺測量；莖粗(莖基部)用游標卡尺測量；地上部和地下部鮮質量、干質量用稱量法和烘干法測量。

線粒體的提取和線粒體特性檢測參照蘇宏等[17]的方法。線粒體膜通透性的檢測：配制緩沖液(220 μmol/L甘露醇，70 μmol/L蔗糖，4.2 μmol/L琥珀酸鈉，pH值7.2)制備線粒體懸浮液，并用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量后調整懸浮液蛋白濃度為0.3 mg/mL，將懸浮液置于20 ℃恒溫箱中保溫2 min后，紫外分光光度計檢測540 nm處的吸光度變化。線粒體膜電位測定：配制緩沖液(250 μmol/L蔗糖，2 μmol/L Hepes，0.5 μmol/LKH2PO4，4.2 μmol/L琥珀酸鈉，pH值7.4)制備線粒體懸浮液，并調整懸浮液蛋白濃度為0.3 mg/mL。加入羅丹明123(1 mg/mL)在25 ℃恒溫箱中保溫30 min孵育后，熒光分光光度計(激發(fā)波長為505 nm，發(fā)射波長為534 nm)上檢測熒光強度，每個樣品測定3次，每次間隔5 min，樣品熒光強度取3次的平均值。線粒體細胞色素c/a測定：用牛血清白蛋白(0.2 %)制備線粒體懸浮液，調整懸浮液蛋白含量為0.5 mg/mL。紫外分光光度計檢測550 nm和630 nm處的吸收值，2種波長的吸收值之比即為Cyt c/a。

2 結果與分析

2.1 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響

如表1所示Cd脅迫導致平邑甜茶幼苗的株高、莖粗、地上部干、鮮質量，地下部干、鮮質量顯著下降，明顯抑制幼苗生長。Cd脅迫下分別添加外源H2S供體NaHS和CaCl2均緩解了Cd對幼苗生長的抑制，株高、莖粗和植株干鮮質量均顯著增加，二者緩解水平相當；Cd脅迫下添加NaHS的同時添加鈣離子專一螯合劑EGTA，鈣離子通道阻斷劑LaCl3或鈣調素拮抗劑CPZ抑制了外源H2S對平邑甜茶幼苗生長的緩解作用，株高、莖粗、地上部干質量和地下部干、鮮質量都比Cd脅迫下僅添加NaHS的顯著下降(表1)。

表1 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗生長的影響Tab.1 Effects of Ca2+ and H2S on growth of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

注：同列數(shù)值后不同字母表示差異性達5%顯著水平。圖1-4同。

Note：Different letters within the same column indicate significant difference at 5% level. The same as Fig.1-4.

2.2 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系細胞死亡的影響

伊文思藍(Evans blue)是可透過受損的細胞膜將細胞染成藍色的非侵透性染料，被細胞截留的伊文思藍量可用來反映細胞的受損程度，染色越深根系活力越低，死亡細胞數(shù)量越多[3]。如圖1所示，200 μmol/L CdSO4處理平邑甜茶根系48 h，可導致根系細胞截留伊文思藍量顯著增加，說明大量根系細胞死亡。Cd脅迫下添加NaHS，在外源H2S的作用下，根系細胞死亡數(shù)量比單獨Cd處理降低了40.4%。Cd脅迫下添加外源Ca2+也降低了根系細胞死亡數(shù)量，與Cd+NaHS處理的水平相當，而比單獨Cd處理的降低了39.3%，差異顯著。而Cd脅迫下添加NaHS的同時添加EGTA、LaCl3或CPZ的處理根系細胞死亡數(shù)量又高于Cd+NaHS的處理。

圖1 Ca2+和H2S對 Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系細胞死亡數(shù)量的影響Fig.1 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the cell death quantity in roots of Malus hupehensisRehd. seedlings under Cd stress

2.3 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系產生速率、H2O2和MDA含量的影響

由圖2-B可知，相同處理下，平邑甜茶根系H2O2含量(以鮮質量計)變化與超氧陰離子產生速率的變化基本一致：Cd脅迫下，根系活性氧爆發(fā)，H2O2含量保持在較高水平；Cd+NaHS和Cd+CaCl2處理的H2O2含量分別比單獨Cd處理的顯著降低了30.7%和29.6%，二者水平相當；Cd+ NaHS+EGTA、 Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的H2O2含量比Cd+NaHS處理的又分別提高了30.3%,24.0%和30.0%，差異顯著。

Cd脅迫下，蘋果幼苗根系內MDA含量(以鮮質量計)顯著提高，比對照增加了45.0%；添加外源H2S顯著緩解了Cd脅迫下MDA在根系中的積累，MDA含量比單獨Cd脅迫處理降低了25.9%；Cd+ NaHS +EGTA、 Cd+ NaHS +LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理抑制了單獨H2S的作用，與單獨Cd脅迫處理水平相當。Cd脅迫下添加外源Ca2+也抑制了MDA產生，MDA含量比單獨Cd脅迫處理降低了16.8%(圖2-C)。

圖2 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系產生速率、H2O2和MDA含量的影響Fig.2 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the production rate， H2O2 content and MDA content in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.4 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的影響

Cd脅迫條件下，平邑甜茶幼苗根系SOD活性(以鮮質量計)明顯升高，比對照高74.7%。Cd脅迫下添加NaHS或CaCl2處理的均進一步提高了根系SOD活性，分別比Cd單獨處理的增加了31.8%和41.5%。Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的抑制了H2S的作用，SOD活性較Cd+NaHS處理的顯著下降，與單獨Cd脅迫處理水平相當(圖3-A)。

由圖3-B、C可知，POD和CAT活性(以鮮質量計)的變化趨勢與SOD相似，即Cd脅迫下顯著高于對照，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2處理的進一步提高，Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的顯著抑制了H2S的作用，與單獨Cd脅迫處理水平相當。

圖3 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系抗氧化酶活性的影響Fig.3 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the antioxidant enzymes activities in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

2.5 Ca2+和H2S對Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系線粒體特性的影響

線粒體膜通透性轉變通道(Mitochondrial permeability transition pore，MPTP)的開放程度決定膜通透性(MPT)的轉變，MPTP的過度開放使MPT不斷增大，線粒體膜蛋白在540 nm處的吸光度減小。如圖4-A，在單獨Cd處理下根系線粒體膜蛋白吸光度顯著低于對照。Cd脅迫下NaHS或CaCl2處理穩(wěn)定了Cd脅迫下根系線粒體膜的通透性，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2處理下MPTP開放程度分別比Cd處理降低了21.0%，18.8%。Cd+NaHS+EGTA、Cd+NaHS+LaCl3或Cd+NaHS+CPZ處理的不同程度上抑制了H2S的作用，其中Ca2+專一螯合劑EGTA，Ca2+通道阻斷劑LaCl3的抑制效果顯著，MPTP開放程度比Cd+NaHS處理的又分別提高了9.72%和9.14%。鈣調素拮抗劑CPZ抑制效果稍差，MPTP開放程度比Cd+NaHS處理的提高了8.02%。

線粒體膜電位(Δψm)是評價線粒體功能的特征指標，MPTP的過度開放會導致Δψm不可逆地改變。Cd處理的根系線粒體Δψ與對照相比顯著降低。Cd脅迫下添加NaHS提高了線粒體Δψ，與單獨Cd處理差異顯著；Cd脅迫下添加NaHS的同時添加Ca2+專一螯合劑EGTA，Ca2+通道阻斷劑LaCl3和鈣調素拮抗劑CPZ抑制了H2S的作用，根系線粒體Δψ與Cd+NaHS處理的均差異顯著。Cd脅迫下添加外源Ca2+處理的根系線粒體Δψ與Cd+NaHS處理的水平相當(圖4-B)。

與對照相比，在Cd處理下，隨著MPTP 開放程度的增大，Δψm的降低，Cyt c/a 也顯著降低。與單獨Cd脅迫相比，Cd+ NaHS和Cd+CaCl2處理顯著提高了根系線粒體Cyt c/a。而Cd脅迫下添加NaHS的同時，添加鈣離子相關抑制劑均顯著抑制了H2S的緩解作用，其中Cd+ NaHS +CPZ處理的抑制效果最明顯，Cyt c/a比Cd+NaHS處理降低了29.9%(圖4-C)。

圖4 Ca2+和H2S誘導Cd脅迫下平邑甜茶幼苗根系線粒體膜透性、膜電位和細胞色素c/a的影響Fig.4 Effect of Ca2+ and hydrogen sulfide on the membrane absorbance， Δψ，Cyt c/a of mitochondrial in roots of Malus hupehensis Rehd. seedlings under Cd stress

3 討論

已有研究發(fā)現(xiàn)，在較嚴重的脅迫條件下，線粒體是響應逆境信號的初始位點，通過啟動一系列代謝過程來增強植物的環(huán)境適應[17]。鎘脅迫下連接線粒體內外膜的MPTP過度開放，使線粒體膜MPT不斷增大，導致呼吸鏈解偶聯(lián)，Δψm下降甚至消失，松散得結合在線粒體內膜上的Cyt c穿過線粒體膜進入細胞質。Cyt c是線粒體電子傳遞的組成成分，它的脫落破壞線粒體抗氧化防御體系，導致ROS和MDA等物質的大量產生，誘導細胞死亡，使細胞正常生理代謝受阻，幼苗生長受到明顯抑制[3]。

近年來越來越多的證據(jù)表明，H2S可以通過調節(jié)抗氧化酶活性和非酶類物質含量，清除細胞內過量的ROS，緩解逆境對細胞的氧化損傷[6-7，11]。但H2S對植物遭遇鎘脅迫后的線粒體功能是否具有調節(jié)作用未見報道。本試驗中在鎘脅迫下添加NaHS處理可顯著減少平邑甜茶幼苗根系細胞的死亡數(shù)量，減輕Cd對幼苗生長的抑制。這可能是由于外源H2S可有效提高線粒體的完整性，抑制線粒體內ROS的產生；同時H2S激活了抗氧化酶系統(tǒng)，SOD、CAT、POD活性增強，使產生的ROS能很快被還原，減輕Cd脅迫引起的膜脂過氧化對線粒體膜的傷害和對電子傳遞鏈的阻抑，保護了線粒體功能，緩解傷害。

植物在受到非正常刺激時，可以通過細胞質膜上Ca2+通道的開放或細胞內鈣庫的Ca2+釋放提高細胞質基質中的Ca2+水平，從而形成Ca2+信號，引發(fā)系列生理生化代謝[18-19]。已有研究表明，一定濃度的外源Ca2+處理可以有效提高大蒜對鎘脅迫的抗性及葡萄對光氧化脅迫的適應[20-21]。本研究中，Cd脅迫下添加外源Ca2+處理減小了根系MPTP 的開放程度，顯著提高了根系線粒體的Δψm和抗氧化酶活性，使ROS的水平顯著低于單獨Cd處理，膜脂過氧化保持在較低的水平，最終緩解了Cd脅迫對幼苗生長的抑制。但添加NaHS的同時添加鈣離子專一螯合劑EGTA，鈣離子通道阻斷劑LaCl3或鈣調素拮抗劑CPZ后，外源H2S的作用被解除。這是因為逆境下胞外Ca2+通過Ca2+通道的激活進入胞內，引起胞質Ca2+濃度瞬間增加，Ca信號與其靶蛋白CaM結合成Ca2+-CaM啟動復雜的信號轉導體系，導致植物做出相應的應答反應[22]。本試驗中，當Ca2+被EGTA螯合、Ca2+通道被LaCl3抑制及Ca2+-CaM的生成被CPZ抑制時，Ca2+的信號傳導被阻斷，使Ca2+對植物體的生理功能被解除。這表明，Ca2+在H2S誘導的保護酶活性增強，線粒體功能穩(wěn)定，活性氧清除能力提高，膜脂過氧化降低，從而緩解鎘脅迫傷害的過程中起重要作用，而H2S的作用可能依賴于Ca2+。植物響應逆境的信號傳導是復雜的網(wǎng)絡系統(tǒng)，可能存在多種交叉對話，在某個地方匯集啟動Ca2+依賴或非依賴性的信號傳導途徑，因此，明確H2S和Ca2+的作用需要進一步的試驗支持。

參考文獻：

[1] Azevedo R A，Gratao P L，Monteiro C C，et al. What is new in the research on cadmium-induced stress in plants?[J]. Food and Energy Security，2012，1(2)：133-140.

[2] Bartoli C G，Gomez F，Martinez D E，et al. Mitochondria are the main target for oxidative damage in leaves of wheat (TriticumaestivumL.)[J]. Journal of Experimental Botany，2004，55(43)：1663-1669.

[3] 姜倩倩. 鎘脅迫下平邑甜茶根系細胞死亡及其中介因素研究[D]. 泰安：山東農業(yè)大學，2011.

[4] Li Z G，Gong M，Liu P. Hydrogen sulfide is a mediator in H2O2-induced seed germination inJatrophaCurcas[J]. Acta Physiologiae Plantarum，2012，34(6)：2207-2213.

[5] Garc′a-Mata C，Lamattina L.Hydrogen sulphide，a novel gasotransmitter involved in guard cell signaling[J]. The New Phytol，2010，188(4)：977-984.

[6] 周超凡，吳幗秀，李 婷，等. 外源 H2S 對低溫下日光溫室黃瓜光合作用及抗氧化系統(tǒng)的影響[J]. 園藝學報，2016，43(3)：462-472.

[7] Zhang H，Hu S L，Zhang Z J，et al. Hydrogen sulfide acts as a regulator of flower senescence in plants[J]. Postharvest Biology and Technology，2011，60(3)：251-257.

[8] Christou A，Manganaris G A，Papadopoulos I，et al. Hydrogen sulfide induces systemic tolerance to salinity and non-ionic osmotic stress in strawberry plants through modification of reactive species biosynthesis and transcriptional regulation of multiple defence pathways[J]. Journal of Experimental Botany，2013，64(7)：1953-1966.

[9] Chen J，Wang W H，Wu F H，et al. Hydrogen sulfide alleviates aluminum toxicity in barley seedlings[J]. Plant and Soil，2013，362(1/2)：301-318.

[10] Li Z G，Ding X J，Du P F. Hydrogen sulfide donor sodium hydrosulfide-improved heat tolerance in maize and involvement of proline[J]. Journal of Plant Physiology，2013，170(8)：741-747.

[11] Cui W T，Chen H P，Zhu K K，et al. Cadmium-induced hydrogen sulfide synthesis is involved in cadmium tolerance inMedicagosativaby reestablishment of reduced (homo) glutathione and reactive oxygen species homeostases[J]. PLoS One，2014，9(10)：e109669.

[12] Fang H H，Jing T，Liu Z Q，et al. Hydrogen sulfide interacts with calcium signaling to enhance the chromium tolerance inSetariaitalica[J]. Cell Calcium，2014，56(6)：472-481.

[13] Li Z G，Gong M，Xie H，et al. Hydrogen sulfide donor Sodium hydrosulfide-induced heat tolerance in tobacco (NicotianatabacumL.) suspension cultured cells and involvement of Ca2+and calmodulin[J]. Plant Science，2012，185(9)：185-189.

[14] 魏國芹，曹 輝，孫玉剛，等. 硫化氫對淹水平邑甜茶根系形態(tài)構型，葉片活性氧和光合特性的影響[J]. 應用生態(tài)學報，2017，28(10)：3267-3273.

[15] Steffens B，Sauter M. Epidermal cell death in rice is regulated by ethylene，gibberellin，and abscisic acid[J]. Plant Physiology，2005，139(2)：713-721.

[16] 趙世杰，史國安，董新純. 植物生理學實驗指導[M]. 北京：中國農業(yè)科技出版社，1998.

[17] 蘇 宏，李麗杰，馬懷宇，等. 變溫條件下鈣對山定子根系線粒體功能的影響[J]. 中國農業(yè)科學，2014，47(19)：3866-3873.

[18] 張 召，梁元存，王 利，等. 鈣對酸化處理平邑甜茶根系抗氧化酶活性及線粒體功能的影響[J]. 林業(yè)科學，2012，48(8)：87-93.

[19] 應葉青，杜 旭，華姜琴，等. 干旱脅迫下毛竹根尖Ca2+分布及外源Ca2+作用機制[J]. 林業(yè)科學，2013，49(4)：141-146.

[20] 李 賀，連海峰，劉世琦，等. 鎘脅迫對大蒜苗生理特性的影響及施鈣的緩解效應[J]. 應用生態(tài)學報，2015，26(4)：1193-1198.

[21] 王曉芳，相 昆，孫 巖，等. 葉面肥對“巨峰”葡萄光氧化脅迫的緩解效應[J]. 果樹學報，2017，34(3)：312-320.

[22] Yang T B，Poovaiah B W. Calcium/calmodulin-mediated signal network in plants[J]. Trends in Plant Science，2003，8(10)：505-512.