甲魚蛋白肽的抗腫瘤作用及其對微管蛋白聚合-解聚的影響

馬遜斌，樓博，何晨怡，王楠*，王偉

(1.浙江樹人大學 生物與環(huán)境工程學院，浙江 杭州 310015； 2.浙江省農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標準研究所，浙江 杭州 310021)

癌癥是嚴重危害人類健康的重大疾病。從天然動、植物中尋找高效的抗癌活性物質(zhì)已成為近年來的研究熱點。抗腫瘤肽具有分子質(zhì)量小、極易穿透癌細胞、穩(wěn)定性較強等特點，可以通過提高免疫應(yīng)答、抑制腫瘤血管形成等抑制腫瘤生長和轉(zhuǎn)移[1]，根據(jù)作用機制分為受體干擾肽、蛋白間抑制肽、酶抑制肽和核酸間作用肽[2]。微管是真核細胞中重要的結(jié)構(gòu)組分，由α和β微管蛋白異二聚體裝配成長管狀纖維結(jié)構(gòu)[3]，作為細胞結(jié)構(gòu)的組成部分參與多種細胞器的組成，在細胞分裂的有絲分裂期，微管蛋白起著決定性的作用[4]。已有研究發(fā)現(xiàn)，很多化合物能與微管蛋白結(jié)合，通過干擾微管的動力學行為，達到抑制微管正常功能的目的，導致有絲分裂障礙，誘導腫瘤細胞凋亡[5-7]，抑制微管功能已成為重要的發(fā)現(xiàn)抗腫瘤化合物的策略。

甲魚又稱鱉、潭魚、嘉魚、水魚，是一種珍貴的水生經(jīng)濟動物。甲魚肉質(zhì)鮮嫩，含有豐富的蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)元素及不飽和脂肪酸，具有強身健體、提高免疫、延年益壽、防癌抗癌的功效，是藥食同源佳品[8-11]。本研究以甲魚為原料制備甲魚蛋白肽，并研究甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚的影響，為抗腫瘤活性肽的開發(fā)提供支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑

甲魚購自農(nóng)貿(mào)市場，4-嗎啉乙磺酸(MES)購自北京沃凱生物科技有限公司，EGTA、ATP、GTP、分離膠、濃縮膠、福林酚購自北京索萊寶科技有限公司，牛血清白蛋白購自SIGMA-ALDRICH公司，MgCl2、丙三醇、鹽酸、無水碳酸鈉、酒石酸鉀鈉、硫酸銅、甲醇、冰醋酸購自國藥集團化學試劑有限公司，考馬斯亮藍R250購自白鯊生物科技，過硫酸銨購自廈門海標科技有限公司，四甲基乙二胺購自福州飛凈生物科技有限公司，蛋白上樣緩沖液購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司。

1.1.2 儀器

臺式高速冷凍離心機，德國賀利氏公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州市金壇友聯(lián)儀器研究所；UV-124紫外可見分光光度計，島津(中國)有限公司；XW-80A漩渦混勻機，上海精科實業(yè)有限公司；電泳儀、凝膠成像儀，美國伯樂公司。

1.2 方法

1.2.1 甲魚蛋白肽制備

甲魚宰殺→去脂→脫殼→打漿→凍干→中性蛋白酶酶解4 h→滅酶(100 ℃，10 min)→離心過濾(4 000 r·min-1，10 min)→取上清液→冷凍干燥→保存，備用[12]。

1.2.2 MTT法檢測甲魚蛋白肽對腫瘤細胞增殖的影響

取對數(shù)期的人肝癌細胞株HEPG2細胞，用質(zhì)量分數(shù)0.25%胰酶消化，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋，制備1×105cell·mL-1的細胞懸液。將細胞懸液每孔100 μL接種于96孔板，置于37 ℃、5% CO2飽和濕度的孵箱內(nèi)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后棄培養(yǎng)液，加入100 μL不同質(zhì)量濃度的待測樣品(6.25、12.5、25、50、100 μg·mL-1)。同時設(shè)立空白組(只加培養(yǎng)液)和對照組(只加細胞和培養(yǎng)液)，每組設(shè)3個平行孔，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，每孔加入20 μL的5 mg·mL-1MTT溶液，孵育4 h，棄上清液，每孔加入150 μL DMSO，15 min后用酶標儀在波長490 nm處測定其吸光度值(D490)[13]，計算細胞增殖抑制率，并用多元回歸法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.2.3 微管蛋白的分離與純化

參照Landino等[14]方法進行豬腦微管蛋白提取。把新鮮的成年豬腦置于冰水中，浸泡一段時間后，去除腦膜、大血管，用預冷的MES緩沖液清洗，制成勻漿。將腦組織勻漿4 ℃ 10 000 r·min-1離心1 h，提取上清液，加入相同體積的MES聚合緩沖液，37 ℃水浴30 min，輕微搖晃數(shù)次，26 ℃ 10 000 r·min-1離心1 h，去除上清，用MES緩沖液預冷卻，冰水浴30 min至沉淀物基本溶解，然后將溶液在高溫和低溫下各離心1次，離心得到的沉淀用少量MES緩沖液溶解在冰水浴中，得到微管蛋白溶液。

1.2.4 微管蛋白含量測定

參考李榮貞等[15]方法測定微管蛋白含量。

1.2.5 微管蛋白的鑒定

用質(zhì)量分數(shù)為12%的分離膠(pH 8.8)、5%的濃縮膠(pH 6.7)進行SDS-PAGE電泳，0.05%考馬斯亮藍R250染色并觀察。

1.2.6 微管蛋白聚合和解聚動態(tài)平衡反應(yīng)

在冰浴的比色皿中加入已純化的微管蛋白195 μL，然后加入ATP 5 μL，使其終濃度為1 mmol·L-1。在4 ℃、350 nm處迅速調(diào)零，置于37 ℃水浴中恒溫，每隔3 min取出測定吸光度D350，根據(jù)所測得的吸光度的變化繪制微管蛋白聚合曲線。當聚合曲線逐漸上升進入穩(wěn)定高平臺期時說明微管蛋白聚合反應(yīng)趨于平衡，待聚合反應(yīng)基本結(jié)束后，將比色杯放入冰水中冰浴20 min，在此期間每間隔3 min測定D350，當解聚曲線逐漸下降并進入低平臺期后，解聚反應(yīng)基本結(jié)束。

1.2.7 甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚活性的影響

在上述微管蛋白聚合-解聚的反應(yīng)系統(tǒng)中，實驗組加入不同濃度的甲魚蛋白肽(5 μL)，使其終濃度分別為0.5、0.75、1.5 mg·mL-1，按1.2.6節(jié)的測定方法記錄D350的變化。

1.2.8 結(jié)果評價

抑制率=100%(對照組D350-實驗組D350)/對照組D350。

2 結(jié)果與分析

2.1 甲魚蛋白肽對腫瘤的抑制活性

以不同濃度的甲魚蛋白肽(6.25～100 μg·mL-1)處理人肝癌HEPG2細胞72 h，設(shè)空白和對照，結(jié)果如圖1。與對照組相比，在各濃度觀察點甲魚蛋白肽均有顯著的抑制作用(P<0.05)，有效濃度為6.25～100 μg·mL-1，并呈良好的量效關(guān)系，半抑制濃度(IC50)為228.49 μg·mL-1。

圖1 甲魚蛋白肽對HEPG2細胞增殖的劑量依賴抑制效應(yīng)

2.2 微管蛋白含量的測定與鑒定

按Lowry法[15]測定總蛋白濃度為13.95 g·L-1，經(jīng)SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示，總蛋白樣品中主要組分的相對分子質(zhì)量介于45.0×103～66.2×103，與文獻所報道相符[16]，因此，圖2中出現(xiàn)的蛋白條帶即為本實驗所需的微管蛋白。

圖2 豬腦微管蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

2.3 微管蛋白聚合和解聚動態(tài)平衡反應(yīng)

微管蛋白在37 ℃條件下聚合(0～10 min)，在4 ℃條件下解聚(40～60 min)，平臺期反應(yīng)了微管蛋白在聚合條件下聚合-解聚之間的動態(tài)平衡(圖3)。微管蛋白在正常的生理條件下處于聚合-解聚動態(tài)平衡中，從而在細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、細胞分裂和運動中起著重要作用。

圖3 微管蛋白在37 ℃時的聚合與4 ℃時的解聚曲線

2.4 甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚反應(yīng)的影響

根據(jù)其具體結(jié)合部位的不同，主要分為3類：紫杉醇位點抑制劑，長春堿位點抑制劑和秋水仙堿位點抑制劑。結(jié)合于紫杉醇位點的化合物是抑制微管蛋白解聚的微管蛋白聚合劑；而結(jié)合于后2個位點的抑制劑則正好相反，為微管蛋白解聚劑。無論是抑制聚合還是抑制解聚，均是通過干擾微管的動力學行為，而達到抑制微管正常功能的目的[17-19]。

從圖4可看出，甲魚蛋白肽對微管蛋白的聚合有明顯的抑制作用，且與濃度有關(guān)。甲魚蛋白肽的終濃度為0.5、0.75、1.5 mg·mL-1時，對微管蛋白聚合的抑制率分別為19.7%、25.6%、40.2%。甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合的抑制作用與濃度呈正相關(guān)。

圖4 甲魚蛋白肽對微管蛋白聚合-解聚反應(yīng)的影響

3 討論

國內(nèi)外有關(guān)生物活性肽及其抗腫瘤的研究已顯示出強大的應(yīng)用和開發(fā)前景[20-24]。1976年P(guān)ettit首次從海兔中發(fā)現(xiàn)環(huán)肽類抗腫瘤活性成分，其后從海兔中分離出一系列含量很低的小分子肽。易楊華等[23]從我國西沙群島永興島棕色海綿提取到一種新的類環(huán)肽化合物，具有較好的抗腫瘤活性。海鞘是抗腫瘤活性肽的重要資源之一[24]。研究人員從海洋藻類、魚類和貝類中發(fā)現(xiàn)了許多高活性的抗腫瘤肽[25-27]。本實驗以中性蛋白酶酶解制備的甲魚蛋白肽，在實驗濃度范圍內(nèi)均有抑制肝癌HEPG2細胞增殖的作用。

微管是抗腫瘤藥物的重要作用靶點，微管蛋白在有絲分裂中的重要作用，使之成為抗腫瘤藥物的有力靶點。迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了多種生物活性肽能夠影響微管蛋白的聚合-解聚。Pettit從海兔中分離出Dolastatin 10和Dolastatin 15能夠抑制微管聚合并促進其解聚，干擾腫瘤細胞的有絲分裂[22]。王翠翠等[28]研究表明，文蛤多肽能夠干擾微管蛋白的聚合。本實驗研究表明，甲魚蛋白肽對微管蛋白的聚合具有抑制作用，且與濃度呈正相關(guān)，提示甲魚蛋白肽具有潛在的抑制微管蛋白聚合的作用。

4 小結(jié)

本實驗評價了甲魚蛋白肽的抗腫瘤作用，在6.25～100 μg·mL-1，甲魚蛋白肽具有抑制腫瘤作用，并呈良好的量效關(guān)系，IC50為228.49 μg·mL-1。甲魚蛋白肽對微管蛋白的聚合具有抑制作用，且與濃度呈正相關(guān)，1.5 mg·mL-1的甲魚蛋白肽的抑制率達40.2%，提示甲魚蛋白肽對微管蛋白動態(tài)平衡體系的影響可能是抑制腫瘤細胞增殖的途徑之一。