鋅對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響及其機(jī)制

吳禮貴，鄒小明，楊方社，龔錦程，黃 浩，曾慶華 ，張傳庭

（1.西北大學(xué)城市與環(huán)境學(xué)院，陜西西安710127；2.井岡山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，江西吉安343009）

我國(guó)水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題較為突出，許多河湖都 出現(xiàn)了水體富營(yíng)養(yǎng)化現(xiàn)象，而導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化的主要元素是排放的工業(yè)生產(chǎn)廢水及生活污水中的磷元素〔1〕。為解決水體富營(yíng)養(yǎng)化問(wèn)題，我國(guó)對(duì)污（廢）水排放標(biāo)準(zhǔn)中磷的去除提出了更高的要求。目前，國(guó)內(nèi)外常用的污（廢）水除磷方法主要有生物除磷和化學(xué)除磷。其中，生物法中的強(qiáng)化生物除磷（EBPR）工藝因具有經(jīng)濟(jì)高效且污泥產(chǎn)量低等特點(diǎn)，在世界各地的污水處理廠中被廣泛采用〔2〕。EBPR系統(tǒng)中一類(lèi)能夠在厭氧條件下釋磷、好氧條件下過(guò)量吸磷的微生物——聚磷菌（PAOs）在除磷過(guò)程中起著重要作用。PAOs能夠在厭氧條件下將可揮發(fā)性脂肪酸（VFAs）轉(zhuǎn)化為聚羥基烷酸酯（PHA）儲(chǔ)存在體內(nèi)，糖原的降解為此過(guò)程提供還原力。在之后的好氧階段，PAOs分解PHA產(chǎn)生能量，并利用此能量吸收水中的磷酸鹽及合成糖原〔3〕。由于PAOs在好氧段的吸磷量大于厭氧段的釋磷量，故可通過(guò)在好氧結(jié)束時(shí)排放含磷污泥達(dá)到除磷的目的。

在污水處理過(guò)程中，Zn2+被頻繁檢出。工業(yè)廢水中的 Zn2+可達(dá) 30~300 mg/L〔4〕。 Zn2+存在于污水處理系統(tǒng)中，可能會(huì)對(duì)系統(tǒng)中的功能微生物（聚磷菌、硝化菌及反硝化菌等）造成不良影響，進(jìn)而影響系統(tǒng)的污染物凈化能力?，F(xiàn)階段，已有學(xué)者開(kāi)展了Zn2+對(duì)污水處理工藝脫氮除磷性能影響的研究〔5〕。然而，Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)的影響及其作用機(jī)理尚不清楚。

為此，本研究采用活性污泥構(gòu)建EBPR除磷體系，探究了如下幾個(gè)問(wèn)題:（1）Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響；（2）Zn2+對(duì)PAOs代謝中間產(chǎn)物的影響；（3）Zn2+對(duì)與PAOs除磷密切相關(guān)的關(guān)鍵酶〔多聚磷酸鹽激酶（PPK）、多聚磷酸鹽酯酶（PPX）及腺苷酸激酶（ADK）〕活性以及細(xì)胞膜完整性的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用泥及實(shí)驗(yàn)廢水

實(shí)驗(yàn)接種污泥取自吉安市新源污水處理廠，該污泥具有良好的脫氮除磷性能。實(shí)驗(yàn)?zāi)M廢水組成見(jiàn)表1。以CH3COONa作為單一碳源（COD為400 mg/L），KH2PO4為磷源〔可溶性正磷酸鹽（SOP）為 10 mg/L〕，NH4Cl為氮源（NH4+-N 為 20 mg/L）。 C4H8N2S用于抑制硝化細(xì)菌的生長(zhǎng)。所用化學(xué)試劑均購(gòu)自上海阿拉丁有限公司，為分析純。

1.2 反應(yīng)器構(gòu)建及運(yùn)行

聚磷菌富集實(shí)驗(yàn)在有效容積50 L的序批式反應(yīng)器（SBR）中進(jìn)行，進(jìn)水體積為25 L，實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。每晝夜運(yùn)行3個(gè)周期，1個(gè)周期包括進(jìn)水10 min、厭氧 2 h、好氧 3 h、沉淀 1 h、排水 10 min 及閑置100 min。反應(yīng)器污泥齡控制在15 d左右。厭氧段 DO 控制在（0±0.1）mg/L，好氧段 DO 控制在（6.5±0.5）mg/L，反應(yīng)器放置在（21±1）℃的恒溫室中。 聚磷菌富集期間定期檢測(cè)反應(yīng)器水質(zhì)變化?；钚晕勰嘟?jīng)過(guò)40 d左右的培養(yǎng)馴化后，系統(tǒng)釋磷、吸磷量穩(wěn)定，除磷率達(dá)到且穩(wěn)定在90%以上，符合EBPR工藝運(yùn)行條件。從該反應(yīng)器中取出5 L活性污泥混合液，離心（4 000 r/min，5 min）去除上清液，然后用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.9%的NaCl溶液清洗3次，重懸浮于500 mL蒸餾水中，分裝至5個(gè)小型SBR反應(yīng)器中。分別加入500 mL人工模擬廢水，再加入Zn2+溶液使得反應(yīng)器中 Zn2+質(zhì)量濃度分別為 0（對(duì)照組）、3、10、30、100 mg/L，最后用去離子水補(bǔ)至1 L。各反應(yīng)器MLSS為（4 000±103）mg/L，MLVSS 為（3 550±78）mg/L。 反應(yīng)器運(yùn)行1個(gè)周期，運(yùn)行條件與聚磷菌富集實(shí)驗(yàn)一致。

表1 實(shí)驗(yàn)?zāi)M廢水組成

圖1 SBR實(shí)驗(yàn)裝置示意

1.3 測(cè)定方法

SOP采用鉬銻抗分光光度法進(jìn)行測(cè)定〔6〕；COD采用重鉻酸鉀法進(jìn)行測(cè)定〔6〕；DO采用便攜式溶解氧儀測(cè)定；糖原采用蒽酮法進(jìn)行測(cè)定〔7〕。PPK、ADK和PPX酶活性的測(cè)定參照文獻(xiàn)〔8〕，所有酶活性均基于蛋白質(zhì)含量，蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用Folin-酚法。通過(guò)乳酸脫氫酶（LDH）活性來(lái)表征細(xì)胞膜完整性〔9〕，LDH活性采用南京建成公司試劑盒測(cè)定。PHA的含量采用氣相色譜法測(cè)定〔10〕。氣相色譜儀為T(mén)M7900II型（天美科學(xué)儀器有限公司），配置氫火焰離子化檢測(cè)器，載氣為氮?dú)?，色譜柱為T(mén)M-5柱（30 m×0.32 mm×0.25μm）；進(jìn)樣器和檢測(cè)器溫度為220℃，采用程序升溫:起始柱溫80℃，停留2 min；然后以8℃/min速度升溫至140℃，停留3 min。一個(gè)樣品的運(yùn)行時(shí)間約10 min，進(jìn)樣量1μL。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差來(lái)表示。應(yīng)用SPSS25.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行單因素方差分析，差異顯著性水平p<0.05。

Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷的抑制率計(jì)算公式:

式中:I——Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷的相對(duì)抑制率，%；

R0——對(duì)照組除磷率；

R——投加Zn2+后反應(yīng)器除磷率。

利用Origin 2019函數(shù)數(shù)據(jù)庫(kù)中的Hill方程對(duì)Zn2+毒性劑量效應(yīng)進(jìn)行擬合，采用模型決定系數(shù)（R2）、加權(quán)卡方檢驗(yàn)系數(shù)（Reduced Chi-Sqr）來(lái)評(píng)價(jià)模型擬合的效果。

2 結(jié)果與討論

2.1 Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)SOP去除及轉(zhuǎn)化的影響

依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，研究了Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)SOP去除的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷性能的抑制作用

由圖2可知，當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)，對(duì)EBPR系統(tǒng)的除磷抑制作用不明顯（p>0.05），抑制率的平均值為2.06%。隨著Zn2+濃度的增加，EBPR系統(tǒng)的除磷抑制率也不斷升高。當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度從10 mg/L增加至100 mg/L時(shí)，系統(tǒng)除磷平均抑制率從40.72%升高至98.05%?；赯n2+濃度與抑制效應(yīng)關(guān)系，采用Hill方程進(jìn)行擬合計(jì)算（R2為0.999，Reduced Chi-Sqr為0.29），發(fā)現(xiàn)Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷的IC50為11.28 mg/L。

此外，依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，研究了不同濃度的Zn2+暴露于EBPR系統(tǒng)1個(gè)周期（8 h）內(nèi)SOP濃度的變化，結(jié)果如圖3所示。

圖3 Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)SOP轉(zhuǎn)化的影響

由圖3可知，當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)，系統(tǒng)的磷釋放和磷吸收能力均未受到顯著影響（p>0.05）；當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度增加到10 mg/L時(shí)，系統(tǒng)厭氧釋磷和好氧吸磷量均明顯降低（p<0.05）；當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度增加到30 mg/L及100 mg/L時(shí)，系統(tǒng)釋磷、吸磷能力進(jìn)一步減弱，厭氧釋磷平均抑制率分別為51.60%、94.83%，好氧吸磷平均抑制率分別為63.99%、96.48%。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Zn2+短期暴露對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響是由Zn2+濃度決定的，較高濃度的Zn2+對(duì)PAOs的釋磷及吸磷進(jìn)程均存在抑制作用。

2.2 Zn2+對(duì)PAOs代謝中間產(chǎn)物的影響

PHA及糖原是PAOs代謝的關(guān)鍵物質(zhì)，PHA的大量積累是PAOs在好氧條件下超量吸磷的保證，且以乙酸鈉作為碳源時(shí)，PHA的成分主要為3-羥基丁酸酯（PHB）和 3-羥基戊酸酯（PHV）〔11〕。 為探究Zn2+對(duì)PAOs體內(nèi)中間代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)化的影響，依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，研究了Zn2+暴露于EBPR系統(tǒng)1個(gè)周期（8 h）內(nèi)系統(tǒng)中PHA及糖原含量的變化，結(jié)果分別如圖4、圖5所示。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)，PHA及糖原的轉(zhuǎn)化曲線與對(duì)照實(shí)驗(yàn)組相比幾乎相同。當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度≥10 mg/L時(shí)，厭氧段PHA的合成、糖原的降解幾乎被完全抑制。相比于對(duì)照實(shí)驗(yàn)組，投加10~100 mg/L的Zn2+，PHA的合成平均抑制率為82.87%~95.59%。在好氧段，當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為10、30 mg/L時(shí)，盡管糖原的合成幾乎被完全抑制，但仍存在PHA的降解；當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度增至100 mg/L，PHA的降解、糖原的合成幾乎被完全抑制。此外，研究表明，各反應(yīng)器活性污泥中PHB占PHA的絕大部分，如對(duì)照組中PHA合成量的平均值為4.99 mmolC/gVSS，其中PHB合成量為3.72 mmolC/gVSS，占比平均值達(dá)74.55%。

圖5 Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)中糖原含量的影響

綜上，較高濃度Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)活性污泥中PHA及糖原的代謝均有抑制作用，最終導(dǎo)致系統(tǒng)除磷性能減弱。較高濃度Zn2+的存在抑制了PAOs厭氧時(shí)多聚磷酸鹽的分解及糖原的降解，從而減少了PHA合成所需的能量、還原力，使得PHA的合成受到影響，導(dǎo)致在好氧段沒(méi)有足夠的PHA降解產(chǎn)生能量供PAOs吸收水中的磷酸鹽。賈利濤等〔5〕也發(fā)現(xiàn)，隨著Zn2+濃度的升高，單級(jí)好氧工藝活性污泥中的PHA合成量與降解量均逐漸減少，除磷效率降低。任志群〔12〕的研究表明，高濃度（25 mg/L）納米ZnO短期暴露于SBR系統(tǒng)對(duì)其除磷性能有顯著不利影響，系統(tǒng)中PHA的合成與降解受到影響，且糖原的變化幅度更大。雖然其采用的研究對(duì)象為納米ZnO，但有研究表明，Zn2+的釋放是導(dǎo)致納米ZnO產(chǎn)生毒性的主要原因〔13〕。其實(shí)驗(yàn)結(jié)果中糖原變化與本研究存在差異，可能是由反應(yīng)器中聚糖菌微生物的豐度差異所導(dǎo)致。

2.3 Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷關(guān)鍵酶活性及細(xì)胞膜完整性的影響

PPX、PPK 及 ADK 是 PAOs除磷的關(guān)鍵酶〔8〕，其中，ADK能與一磷酸腺苷反應(yīng)生成二磷酸腺苷（ADP），從而生成三磷酸腺苷（ATP），為生物代謝提供能量，此過(guò)程是聚磷酸鹽水解的關(guān)鍵反應(yīng)。PPX和PPK分別在厭氧段分解多聚磷酸鹽及好氧段合成多聚磷酸鹽中起關(guān)鍵作用。依據(jù)實(shí)驗(yàn)方法，研究了Zn2+暴露于EBPR系統(tǒng)1個(gè)周期內(nèi)系統(tǒng)中PPX、PPK、ADK活性及LDH釋放量的變化，結(jié)果如圖6所示。

圖 6 Zn2+對(duì) EBPR 系統(tǒng)中 PPX、PPK、ADK 活性（a）及LDH 釋放量（b）的影響（* 表示 p＜0.05；** 表示 p＜0.01）

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，較高濃度的Zn2+對(duì)PAOs中PPX、PPK及ADK活性均有抑制作用，且隨著Zn2+濃度的升高，抑制作用增強(qiáng)〔圖 6（a）〕。當(dāng) Zn2+質(zhì)量濃度為 3 mg/L時(shí)，3種酶活性與對(duì)照組相比均無(wú)顯著性差異（p＞0.05）。 而當(dāng) Zn2+質(zhì)量濃度為 10 mg/L 時(shí)，ADK 活性下降至對(duì)照組的76.83%，與對(duì)照組相比存在顯著差異（p＜0.05）；PPX、PPK活性下降至對(duì)照組的 65.33%、52.48%，較對(duì)照組有極顯著性差異（p＜0.01）。當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度增加到30、100 mg/L時(shí)，3種酶活性幾乎被完全抑制。較高濃度Zn2+抑制3種酶活性的現(xiàn)象與厭氧段釋磷及好氧段吸磷受到的影響一致。因此可得出結(jié)論，較高濃度的Zn2+對(duì)EBPR系統(tǒng)中除磷關(guān)鍵酶（PPX、PPK和ADK）的抑制作用是導(dǎo)致EBPR系統(tǒng)除磷性能降低的重要原因。

現(xiàn)已知金屬離子對(duì)酶的抑制機(jī)理有以下幾方面:（1）進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的重金屬與蛋白酶活性中心的—SH發(fā)生反應(yīng)，或與其他非活性中心部分結(jié)合導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，致使酶活性減弱甚至失活〔14〕；（2）重金屬誘導(dǎo)產(chǎn)生的自由基和活性氧（ROS）抑制了酶活性〔8〕。

細(xì)胞膜是ROS攻擊的重要靶點(diǎn)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，Zn2+（3～100 mg/L）短期暴露對(duì) EBPR 系統(tǒng)中微生物細(xì)胞膜完整性未造成顯著影響〔圖6（b）〕，說(shuō)明機(jī)理（1）導(dǎo)致3種酶活性降低的可能性更大。Xiong Zheng等〔15〕的研究也表明，雖然10 mg/L以上的納米ZnO對(duì)SBR系統(tǒng)脫氮除磷有抑制作用，但未對(duì)系統(tǒng)中微生物的細(xì)胞膜完整性造成顯著影響。如前所述，眾多研究表明，Zn2+的釋放是造成納米ZnO產(chǎn)生毒性的主要因素，故可認(rèn)為該結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相一致。但也有研究發(fā)現(xiàn)，長(zhǎng)期投加10 mg/L納米ZnO可破壞活性污泥系統(tǒng)中微生物細(xì)胞膜的完整性〔16〕。Zn2+長(zhǎng)期暴露對(duì)EBPR系統(tǒng)中微生物細(xì)胞膜的影響仍需作進(jìn)一步探究。

3 結(jié)論

采用活性污泥構(gòu)建EBPR體系，研究了Zn2+短期暴露對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷性能的影響及其作用機(jī)理，得到如下結(jié)論:

（1）當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為3 mg/L時(shí)，其對(duì)EBPR系統(tǒng)除磷性能無(wú)顯著影響；當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度為10 mg/L時(shí)，對(duì)系統(tǒng)的除磷抑制作用明顯，相比于對(duì)照組，平均抑制率為40.72%；當(dāng)Zn2+質(zhì)量濃度增加到30、100 mg/L時(shí)，平均抑制率分別升至94.30%、98.05%。

（2）較高濃度的 Zn2+（≥10 m/L）會(huì)影響 PAOs的釋磷及吸磷能力，且會(huì)抑制PHA、糖原的正常代謝，進(jìn)而影響好氧段PAOs分解PHA產(chǎn)生的能量，降低吸磷能力。

（3）較高濃度的 Zn2+（≥10 m/L）會(huì)抑制 EBPR 系統(tǒng)中除磷關(guān)鍵酶ADK、PPX和PPK的活性，從而對(duì)PAOs厭氧釋磷和好氧吸磷造成影響，降低系統(tǒng)的除磷性能。Zn2+（3~100 mg/L）短期暴露對(duì)EBPR系統(tǒng)中微生物細(xì)胞膜完整性無(wú)顯著影響。