安徽地區(qū)不同規(guī)模豬場(chǎng)豬偽狂犬病毒感染情況調(diào)查與分析

黃曉慧 耿鶴鳴 李郁*

1.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 230036

2.安徽省合肥市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 230061

偽狂犬?。≒R）是由偽狂犬病病毒（PRV）感染引起的一種以發(fā)熱、奇癢（豬除外）及腦脊髓炎為主要癥狀的高度接觸性、急性傳染病[1-2]，我國(guó)將其列為二類動(dòng)物疫病。豬是PRV的傳播者和自然宿主[3]，不同日齡豬感染PRV后臨床癥狀不同：母豬出現(xiàn)流產(chǎn)或產(chǎn)死胎、木乃伊胎、弱仔等繁殖障礙疾病；新生仔豬表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、運(yùn)動(dòng)失調(diào)并伴有神經(jīng)癥狀，死亡率可高達(dá)100%；成年豬感染后易發(fā)呼吸系統(tǒng)疾病[4]。我國(guó)自1947年首次報(bào)道以來[5]，此病幾乎遍布我國(guó)大江南北，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。PRV主要通過母豬胎盤和公豬精液垂直傳播，也可水平傳播[6]。偽狂犬病病毒屬于雙股DNA病毒，為皰疹病毒科成員，動(dòng)物一旦被其感染，病毒可在動(dòng)物體內(nèi)呈長(zhǎng)期潛伏感染狀態(tài)，在受到體內(nèi)或者外界因素的刺激后，往往可與其他病原體協(xié)同作用引起多種疾病的發(fā)生，從而引起疫病的爆發(fā)[7]。

疫苗免疫接種是控制偽狂犬病的重要手段，目前我國(guó)使用最為廣泛的是豬偽狂犬病毒gE基因缺失苗[8]。由于疫苗的使用，在近20年來豬偽狂犬病在我國(guó)得到有效的控制。自2011年以來，PRV變異毒株的出現(xiàn)導(dǎo)致豬偽狂犬病的發(fā)病率有上升趨勢(shì)[9]。為進(jìn)一步了解安徽省偽狂犬病毒的感染情況，為防治偽狂犬病作出合理的評(píng)估。2013-2017年期間我們陸續(xù)收集或采集來自336個(gè)豬場(chǎng)的897份樣品，對(duì)偽狂犬病原進(jìn)行了調(diào)查分析。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源897份病原檢測(cè)樣品來自安徽地區(qū)336個(gè)疑似感染PRV野毒的不同規(guī)模豬場(chǎng)的不同生長(zhǎng)階段的豬。樣品包括病死豬以及病豬精液、血液、腦組織、腎臟、淋巴組織以及明顯病變其它臟器組織。樣品按照以下豬場(chǎng)規(guī)模及豬只生長(zhǎng)階段進(jìn)行歸類分析。

自繁自養(yǎng)型基礎(chǔ)母豬數(shù)大于3000頭為大型豬場(chǎng)，小于1000頭為中型豬場(chǎng)，小于100頭為小型豬場(chǎng)，小于10頭為散養(yǎng)戶。

豬只生長(zhǎng)劃分為六階段，即哺乳仔豬（1周齡～4周齡）、保育豬（4周齡～8周齡）、育肥豬（9周齡以上）、種公豬、后備母豬及生產(chǎn)母豬。

1.1.2 試劑DNA提取試劑盒，OMEGA公司產(chǎn)品；2×GC-rich PCR Master Mix、無菌雙蒸水（ddH2O），北京天根生物科技公司產(chǎn)品；DNA Marker DL600、DNA Marker DL2000，Takara公司產(chǎn)品。

1.1.3 引物的設(shè)計(jì)與合成根據(jù)GenBank上登錄的PRVgE基因序列（登錄號(hào)KP098534.1）設(shè)計(jì)一對(duì)特異性 引 物，P1：5’-CCGTGTTCTTTTGGCGGTG-3’，P2：5’-ACCTCCTCGCCGAAGGCGTCGAAG-3’，目的片段大小為423bp，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 待檢病料的準(zhǔn)備主要采集病豬的腦組織、腎臟、淋巴組織以及明顯病變其它臟器組織等，研磨后，反復(fù)凍融3次，5000r/min離15min，取上清液，置于-20℃保存。

1.2.2 PCR檢測(cè)根據(jù)OMEGA的Micro Elute Genomic DNA Kit(50)DNA提取試劑盒的操作步驟提取PRV病毒的基因組DNA。提取的DNA直接進(jìn)行病毒基因檢測(cè)，反應(yīng)體系如下：2×Taq plus PCR Master Mix 12.5μL（Taq DNA 聚合酶、dNTPs 、標(biāo)準(zhǔn)Taq反應(yīng)緩沖液），上游引物1μL，下游引物1μL，DNA模板3μL，ddH2O7.5μL。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性4min；94℃變性1min；63℃退火1min；72℃延伸 1min，40個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。取5μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 結(jié)果判定PCR病原檢測(cè)結(jié)果判定PRV陽性對(duì)照出現(xiàn)423bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無條帶出現(xiàn)時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果成立。被檢樣品出現(xiàn)423bp擴(kuò)增帶為陽性，否則為陰性。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析采用SPSS statistics 20.0，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。利用單因素方差分析LSD多重比較與卡方檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)間比對(duì)，將數(shù)據(jù)進(jìn)行分類，進(jìn)而將每一類別數(shù)據(jù)中的數(shù)據(jù)組進(jìn)行單因素方差分析，當(dāng)p≥0.05時(shí)說明數(shù)據(jù)中不存在顯著性差異，p＜ 0.05時(shí)說明比較的兩組數(shù)據(jù)間存在顯著性差異，若p＜ 0.01時(shí)則兩組數(shù)據(jù)間差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 PRV gE基因PCR檢測(cè)結(jié)果對(duì)897份發(fā)病豬樣品進(jìn)行PRV gE-PCR檢測(cè)，結(jié)果共檢出PRV核酸陽性樣品139份，總體陽性率為15.50%。部分豬場(chǎng)的PCR陽性病料檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果見圖1。

圖1 PRV gE基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.2 不同年份PRV檢出情況2013年、2014年、2015年、2016年與2017年的PRV陽性檢出率分別為1.11%（1/90）、5.35%（9/168）、28.64%（55/192）、21.39%（43/201）、12.60%（31/246）。2013年、2014年之間差異不顯著，2014-2015年病原陽性檢出率呈上升趨勢(shì)；2015年的病原陽性檢出率最高且與其他年份對(duì)比差異顯著。2016-2017年的病原陽性檢出率開始下降且差異顯著，但病原陽性檢出率始終高于2013年與2014年（表1）。

表1 不同年份PRV陽性檢出率

2.3 不同生長(zhǎng)階段PRV檢出情況將送檢病料生長(zhǎng)階段清晰的樣品653份樣品進(jìn)行分類檢測(cè)，PRV陽性檢出率分別為仔豬17.90%（29/162）、保育24.42%（32/132）、育肥14.51%（9/62）、母豬（48/206）、公豬18.68%（17/91），不同生長(zhǎng)階段的PRV陽性檢出率差異不顯著（表2）。

2.4 不同規(guī)模豬場(chǎng)豬群PRV檢測(cè)結(jié)果不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)的PRV檢測(cè)結(jié)果（表3）顯示安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)均存在PRV的野毒感染，小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶的抗體陽性率最高為19.88%（34/171），大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和中等規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)陽性率分別為12.87%（35/272）、15.38%（18/117）。小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶與大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)、中等規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)比較差異極顯著（p＜ 0.01）。

3 討論

本次調(diào)查分析的897份樣品來自安徽地區(qū)336個(gè)疑似感染PRV野毒的不同規(guī)模豬場(chǎng)，結(jié)果顯示所有收檢樣品PRV野毒陽性率為15.50%；說明安徽地區(qū)豬場(chǎng)確實(shí)存在PRV野毒的感染，對(duì)豬場(chǎng)豬群整體健康造成極大的危害，急需制定有效措施進(jìn)行防控。近年來，PRV野毒在我國(guó)豬場(chǎng)中仍普遍存在，并保持一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，不同豬場(chǎng)PRV野毒感染陽性率差異較大，尤其是2012年以來，PR的發(fā)病率有上升趨勢(shì)，但是沒有大規(guī)模的爆發(fā)，呈地方流行性。

表2 不同生長(zhǎng)階段PRV病原陽性檢出率

表3 不同規(guī)模豬場(chǎng)豬群PRV陽性檢出率

安徽地區(qū)不同規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)PRV陽性率的對(duì)比結(jié)果表明，小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)及散養(yǎng)戶的病原陽性率最高，大規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)和中等規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)病原陽性檢出率較低且二者不存在顯著性差異。這可能與小規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)與散養(yǎng)戶由于資金及技術(shù)的限制不能有效監(jiān)控病毒的傳播，往往在豬群發(fā)病時(shí)才能發(fā)現(xiàn)豬群感染了PRV，造成隱形感染和帶毒豬長(zhǎng)期共存而互相感染。同時(shí)其生產(chǎn)管理水平也相對(duì)薄弱，缺乏有效的隔離檢疫制度，對(duì)偽狂犬病的防控意識(shí)及防控措施均重視不夠。

由不同生長(zhǎng)階段豬的PRV野毒感染陽性率統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果可知，母豬、哺乳仔豬、保育豬、中大豬均有檢出，說明不同生長(zhǎng)階段的豬群對(duì)PRV均易感。保育豬豬群的PRV野毒檢出率最高，且這一階段的豬群PRV的發(fā)病率和死亡率都很高，這提示我們保育仔豬免疫受到母源抗體干擾等因素，造成免疫效果不佳，成為高風(fēng)險(xiǎn)的易感豬群。其次母豬群較高的PRV感染會(huì)造成整個(gè)豬場(chǎng)偽狂犬病毒的持續(xù)性感染，因?yàn)槟肛i飼養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，一旦感染PRV野毒，可長(zhǎng)期帶毒排毒。制定合理的免疫程序，免疫接種能夠有效的降低感染的發(fā)生，減少病毒擴(kuò)散，有計(jì)劃的實(shí)行PRV的凈化工作，降低母豬群的PRV野毒感染至陰性狀態(tài)。

疫苗免疫接種是控制該病的主要方法，選擇使用具有較強(qiáng)抗?jié)摲腥灸芰Φ幕蛉笔醵疽呙鐚?duì)于偽狂犬病控制可能更有幫助。而我省不同地區(qū)、不同豬場(chǎng)種豬偽狂犬陽性率的差異可能與選擇不同的疫苗有一定關(guān)系。但是僅僅依靠疫苗免疫并不能徹底控制偽狂犬病的流行，為有效預(yù)防和控制該病的發(fā)生與流行，應(yīng)借鑒發(fā)達(dá)國(guó)家消滅豬偽狂犬病的成功經(jīng)驗(yàn)，引導(dǎo)豬場(chǎng)采取綜合防控措施：1）堅(jiān)持自繁自養(yǎng)、全進(jìn)全出的養(yǎng)殖模式。2）嚴(yán)格引種管理，做好隔離檢疫工作，從源頭上切斷病原。3）定期監(jiān)測(cè)PRV野毒感染抗體，結(jié)果病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果，及時(shí)剔除陽性動(dòng)物，凈化種群。4）加強(qiáng)豬場(chǎng)的飼養(yǎng)管理、營(yíng)養(yǎng)保健，以提升群體抗病能力。此外，還應(yīng)加強(qiáng)豬場(chǎng)的滅鼠、消毒工作，嚴(yán)格禁止外來人員及車輛?？傊?，集約化、規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)是今后養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展方向，而集約化養(yǎng)殖無疑對(duì)于傳染病的控制有著更高的要求。對(duì)于偽狂犬的控制，我們的最終目標(biāo)是逐步凈化以達(dá)到最終的清除，促進(jìn)養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展。