新疆厚皮甜瓜采后病害真菌的鑒定及多樣性分析

鄭賀云,耿新麗,姚 軍,張翠環(huán),廖新福

(新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所，新疆 鄯善 838200)

【研究意義】甜瓜屬于葫蘆科(Cuculacere)黃瓜屬(Cuccmis.L)甜瓜種(CucumismelonL.)，一年生蔓生草本植物。在我國(guó)種植歷史悠久，種植面積和產(chǎn)量均居世界第一，既是新疆的特色名優(yōu)果蔬資源，又是新疆發(fā)展特色農(nóng)業(yè)的主要經(jīng)濟(jì)支柱之一[1]，甜瓜果實(shí)不僅外觀(guān)精美、汁多味甜、氣味芳香，而且還含有豐富的類(lèi)胡蘿卜素、維生素C、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)成分，近年來(lái)備受廣大國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者的青睞。新鮮的甜瓜含水量和含糖量都較高，采摘后仍進(jìn)行生理代謝，采收時(shí)正處于高溫季節(jié)，再加上新疆地處偏遠(yuǎn)的西北，缺乏合理的包裝和有效的冷鏈物流，采后容易受病原菌的浸染[2]，導(dǎo)致果實(shí)腐爛、品質(zhì)和外觀(guān)急速下降，這是制約新疆甜瓜產(chǎn)業(yè)的發(fā)展的最大瓶頸?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】對(duì)甜瓜采后病害的主要致病菌的報(bào)道的已有20多種[3]，鏈格孢(Alternaria)、鐮刀菌(Fusarium)、粉紅單端孢(Trichothecium.)、根霉屬(Rhizopus)、青霉屬(Penicillium)是造成新疆產(chǎn)區(qū)甜瓜貯藏期間發(fā)病腐爛的主要病原微生物，分別引起黑斑病、白霉病、粉霉病、軟腐病和綠霉病[4]。【本研究切入點(diǎn)】近年來(lái)，對(duì)甜瓜采后研究方向都傾向于單一品種病原菌的分離、鑒定和貯藏保鮮的技術(shù)研究，而對(duì)采后不同品種甜瓜被病原菌侵染的種類(lèi)和群落結(jié)構(gòu)的研究報(bào)道尚少?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以西州密17號(hào)、金龍和水晶綠甜瓜為研究對(duì)象，對(duì)引起甜瓜果實(shí)采后病害病原菌的種類(lèi)和群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，以期為有效防治甜瓜采后病害提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品處理

甜瓜果實(shí)：水晶綠甜瓜(老姑娘)2018年購(gòu)買(mǎi)自新疆阿克陶縣，西州密17號(hào)和金龍2個(gè)品種采自新疆維吾爾自治區(qū)葡萄瓜果研究所試驗(yàn)基地。采集成熟度基本一致、大小一致、無(wú)機(jī)械損傷、無(wú)病蟲(chóng)害的果實(shí)為試驗(yàn)材料，將這3個(gè)甜瓜品種放置室溫(23～25 ℃)條件下貯藏，使其自然發(fā)病。

1.2 菌株的分離純化

果實(shí)自然發(fā)病果面長(zhǎng)出霉層或菌絲后，挑取果面上的菌絲接種到馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基(購(gòu)至廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)上，放置28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。采用劃線(xiàn)法純化菌株，挑取單菌落接種到新的PDA培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)，并將菌株保存在PDA斜面上備用。

1.3 甜瓜采后病害rDNA-ITS序列分析

1.3.1 基因組總DNA的提取 采用改進(jìn)的CTAB法[6]提取供試菌株的基因組總DNA，置于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PCR擴(kuò)增及檢測(cè) 利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(ITS)的通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)[7]對(duì)菌株的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，引物合成由上海生工生物工程有限公司完成。擴(kuò)增體系(50 μl)：正向引物(10 μM)和反向引物(10 μM)各1 μl，DNA模板1 μl，2×EasyTaqPCR SuperMix 25 μl(試劑購(gòu)自全式金生物)，用無(wú)菌ddH2O補(bǔ)充至50 μl。反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，56 ℃(依照合成的引物確定)退火30 s，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR產(chǎn)物檢測(cè)方法：取3 μl產(chǎn)物，利用1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，之后利用凝膠成像系統(tǒng)觀(guān)察拍照[8]。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測(cè)序及系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的構(gòu)建 供試菌株的PCR產(chǎn)物測(cè)序后(生工生物工程(上海)有限公司完成)，所獲得的序列與 GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，獲得與供試菌株的rDNA-ITS序列同源性較高區(qū)，用Clustal X (version 1.83) 軟件的Alignment 程序進(jìn)行多重比對(duì)(Multiplealignment)，采用 Mega (Version 4.0) 軟件包鄰接法 (neighbor-joining) 構(gòu)建分子系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，用Bootstrap自展數(shù)據(jù)集為1000 次對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)置信度進(jìn)行檢測(cè)[9]。

1.4 多樣性分析

1.5 相似性分析

對(duì)不同品種甜瓜采后病原真菌群落組成的相似性水平進(jìn)行Jaccrad相似性指數(shù)(Cj)比對(duì)，分析2個(gè)品種中病原菌種類(lèi)組成的相似程度。其公式為：Cj=c/(a+b-c)，式中，a、b分別為2個(gè)種品種類(lèi)型中病原菌種數(shù)，c為2個(gè)品種類(lèi)型中共有的病原菌種數(shù)[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 構(gòu)建ITS區(qū)rDNA系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析

對(duì)45株菌株的rDNA-ITS基因序列測(cè)定，得到45條有效序列。將rDNA-ITS基因序列在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行Blast比對(duì)，從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索其同源序列，并利用MEGA4軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

從圖1和表1可知，從西州密17號(hào)甜瓜果實(shí)上分離出的27株菌分別屬于5個(gè)不同的屬， 分別為Fusarium、Penicillium、Aspergillus、Botryotinia和Rhizoctonia，其中18株鐮刀菌中39號(hào)菌株ITS序列與有效發(fā)表的菌株Fusariumchlamydosporumstrain FC1B(EU556725.1)的相似度為97.31 %，但在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上兩者距離較近但沒(méi)有單獨(dú)聚類(lèi)成一個(gè)小分支，52號(hào)菌株ITS序列與有效發(fā)表的菌株Fusariumoxysporumisolate LrBF2(MG543720.1)的序列相似度為97.91 %，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上單獨(dú)聚在一個(gè)分支，由于鐮刀菌屬種類(lèi)較多，種內(nèi)遺傳分化水平也較高，形態(tài)也存在變異性和多型性，分類(lèi)較為困難，因此還需對(duì)這兩株菌進(jìn)一步的深入研究研究，從而準(zhǔn)確確定其系統(tǒng)發(fā)育地位；剩余15株鐮刀菌株ITS序列與有效發(fā)表的菌株序列相似度在99 %以上，33號(hào)菌株與Fusariumbrachygibbosum(KU528864.1)的相似度為99.81 %，但是在之前甜瓜采后病害中沒(méi)有相關(guān)菌株的報(bào)道，需進(jìn)一步研究該菌株對(duì)甜瓜的侵染方式以及發(fā)病情況。

從金龍?zhí)鸸仙戏蛛x出的7株菌分別屬于A(yíng)spergillus、Penicillium和Fusarium3個(gè)屬的6個(gè)種，ITS序列與有效發(fā)表的菌株序列相似度都在99 %以上。

從水晶綠甜瓜上分離出的11株菌，分別屬于Diplodiaseriata、Alternaria、Fusarium和Penicillium。鐮刀菌屬5株，其中編號(hào)72-1的菌株的ITS序列與有效發(fā)表的菌株Fusariumgraminearumisolate 23(MF800907.1)的序列相似度為97.63 %，在系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)上兩者卻相距甚遠(yuǎn)，有可能為Fusarium潛在的新種，其分類(lèi)地位有待研究，其它菌株的ITS序列與有效發(fā)表的菌株序列相似度在99 %以上，但是Diplodiaseriata、Fusariumgraminearum和Fusariumproliferatum之前在甜瓜采后病害中均未見(jiàn)報(bào)道，因此編號(hào)為80、76、79-1的菌株侵染甜瓜的方式及發(fā)病情況應(yīng)做進(jìn)一步分析研究。

表1 分離菌株rDNA-ITS 序列相似性分析

續(xù)表1 Continued table 1

菌株編號(hào)Strain No.來(lái)源Source所在屬Genus近似種The nearnest type strain相似度(%)Identity41西州密17號(hào)鐮刀菌屬Gibberella moniliformis strain P6-26(GU723435.1)99.4245西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium incarnatum strain LH26(MG808373.1)99.4241-2西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium oxysporum isolate Fox3(KU528847.1)99.4252西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium oxysporum isolate LrBF2(MG543720.1)97.915西州密17號(hào)鐮刀菌屬Neocosmospora rubicola strain HLGJF1501(MH277488.1)99.2618西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium solani strain G245(KF572442.1)99.0841-1西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium solani isolate Fs(KC156599.1)99.6243西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium solani isolate Fs6(KC156598.1)99.6251西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium solani isolate Fs2(KC156594.1)99.2654西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium solani isolate ITS-4(KY662483.1)99.086西州密17號(hào)鐮刀菌屬Fusarium solani isolate Fso8(KU528858.1)99.444-3金龍青霉菌屬Penicillium cinnamopurpureum strain SCAU150(MF135513.1)99.072-1金龍曲霉屬Aspergillus niger isolate S13(MG654699.1)99.8235-2金龍曲霉屬Aspergillus flavus strain aC4(KU561919.1)99.4635金龍曲霉屬Aspergillus ochraceus internal(KU743890.1)99.2864金龍曲霉屬Aspergillus flavus isolate MC-5-L(KU527785.1)99.653-1金龍鐮刀菌屬Fusarium oxysporum isolate B5Fo(MH368295.1)99.253-2金龍鐮刀菌屬Fusarium solani isolate G6(MF800959.1)99.2672水晶綠甜瓜青霉菌屬Penicillium oxalicum strain SCSAAF0017(JQ647900.1)99.4680水晶綠甜瓜色二孢屬Diplodia seriata isolate Bot-2018-S22(MH675476.1)99.4672-2水晶綠甜瓜鏈格孢屬Alternaria alternata strain MS18-2(KU324787.1)99.6375水晶綠甜瓜鏈格孢屬Alternaria alternata strain ITCC-4312(MH084279.1)99.8178水晶綠甜瓜鏈格孢屬Alternaria tenuissima isolate ZB11263537(KX783377.1)99.8181-1水晶綠甜瓜鏈格孢屬Alternaria alternata isolate KS48T5L(KF380824.1)10070水晶綠甜瓜鐮刀菌屬Fusarium chlamydosporum isolate DS09(KY432359.1)99.2271水晶綠甜瓜鐮刀菌屬Fusarium chlamydosporum isolate LrSF22(MG543702.1)99.6172-1水晶綠甜瓜鐮刀菌屬Fusarium equiseti isolate 5-10-F_G04(KX529083.1)97.6376水晶綠甜瓜鐮刀菌屬Fusarium graminearum isolate 23(MF800907.1)99.6179-1水晶綠甜瓜鐮刀菌屬Fusarium proliferatum strain BH28(MH712158.1)99.81

圖1 從西州密17號(hào)甜瓜果實(shí)中分離出的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of fungus strain in Xizhoumi-17 melon fruit

圖2 從金龍?zhí)鸸瞎麑?shí)中分離出的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of fungus strain in Jinlong melon fruit

圖3 從金龍?zhí)鸸瞎麑?shí)中分離出的菌株系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of fungus strain in Shuijinglv melon fruit

2.2 甜瓜采后病原真菌種類(lèi)與分離頻率

由表2可知，從腐爛的甜瓜上分離出真菌菌株45株，分別為Fusarium、Aspergillus、Penicillium、Alternaria、Rhizoctonia、Diplodia、Botryotinia7個(gè)屬20個(gè)種，其中Fusarium是優(yōu)勢(shì)種群，分離頻率達(dá)到55.56 %；其次是Aspergillus，分離頻率為20 %；Penicillium

表2 甜瓜采后病原真菌種類(lèi)與分離頻率

和Alternaria的分離頻率為8.89 %；Rhizoctonia、Diplodia和Botryotinia的分離頻率均為2.22 %，較為稀少。

由表3可知，不同甜瓜品種采后病原菌的群落和結(jié)構(gòu)之間存在一定的差異。3個(gè)甜瓜品種中，從西州密17號(hào)分離出的病原菌最多分屬5個(gè)屬，其中Fusarium18株為優(yōu)勢(shì)種群，占西州密17號(hào)菌株總數(shù)相對(duì)分離頻率的40 %，其次是Aspergillus共5株占11.1 %；從水晶綠甜瓜中分離到的菌株分布在4個(gè)屬中，F(xiàn)usarium5株，Alternaria4株，Penicillium1株，Diplodia1株，分別占水晶綠甜瓜菌株總數(shù)的相對(duì)分離頻率的11.1 %、8.9 %、2.2 %和2.2 %，金龍分屬3個(gè)屬，分離出的Aspergillus較多，共計(jì)4株，占金龍菌株總數(shù)相對(duì)分離頻率的8.9 %，F(xiàn)usarium和Penicillium相對(duì)較少，分別為4.4 %和2.2 %。

2.3 不同甜瓜品種采后病原真菌多樣性特點(diǎn)

從表4可知，3個(gè)甜瓜品種采后病原菌群落間的多樣性水平存在差異。從病原真菌的數(shù)量上看，西州密17號(hào)的多樣性指數(shù)最高，一共分離出5個(gè)菌屬27株菌，水晶綠甜瓜分離出4個(gè)屬11株菌，而金龍的最低，只分離出3個(gè)屬7株菌；從多樣性水平來(lái)看，西州密17號(hào)分離出的菌群多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)都最高，分別為0.91、0.28、6.83，金龍菌群多樣性指數(shù)、均勻度指數(shù)和豐富度指數(shù)都為最低，分別為0.44、0.23和1.58。

2.4 不同甜瓜品種采后病原菌的相似性

3個(gè)甜瓜品種采后病原菌菌群相似性系數(shù)在0.286～0.400，金龍與水晶綠甜瓜2個(gè)甜瓜品種采后病原真菌群落相似性系數(shù)最高為0.400，而西州密17號(hào)與水晶綠甜瓜采后病原真菌群落的菌群相似性系數(shù)最低為0.286。根據(jù)Jaccrad相似性原理，3個(gè)甜瓜品種的病害真菌群落相似性系數(shù)處于不相似或中等不相似之間?？傮w而言，3個(gè)甜瓜品種采后病害真菌間的相似度均較低。

表3 不同品種甜瓜采后病原菌種類(lèi)與相對(duì)分離頻率

表4 不同甜瓜品種采后病原真菌群落的多樣性水平

表5 不同甜瓜品種采后真菌群落相似性系數(shù)

3 討 論

新疆厚皮甜瓜近年來(lái)具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但是采后貯藏與運(yùn)輸過(guò)程中有侵染型病害發(fā)生，不僅降低果實(shí)的品質(zhì)，甚至失去原有的商品價(jià)值，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。已報(bào)道的引起甜瓜采后腐爛的主要病原菌有Alternaria、Fusarium、Penicillium[13]、Phomadestructiva、Fusariumoxysporm、Penicilliumdigitatum、Alternariatenuis、Curvularialunata、Fusariumequiseti、Trichotheciumroseum[14]、Aspergillus、Mucor、Rhizoctoniasolani[15]、Phomopsisbrevistylospora[16]等，甜瓜采后病害發(fā)生的種類(lèi)較多，不同病害發(fā)生的時(shí)期與條件也有所不同，不同品種的主要致病菌也有所不同，例如，Alternariaalternata和Trichotheciumroseum是“黃河蜜”采后貯藏運(yùn)輸過(guò)程中的主要病害[17]；寧夏中部干旱帶甜瓜“玉金香”的主要病原菌是Alternaria、Trichothecium、Fusarium、Paecilomyces[18]；張有林等人研究伽師瓜采后貯藏病害表明，貯藏期果實(shí)主要受Moniliaceae、Penicillium和P.viridicatumWestling的侵染[19]；引起白蘭瓜腐爛的病原菌主要是FusariumlateritiumNees，Cephalotheciumroseum，Aspergillusspp.，Penicillium，Rhizopusstolonifer，其中F.lateritiumNees危害最為嚴(yán)重[20]。本研究從西州密17號(hào)、金龍、水晶綠甜瓜(老姑娘)3個(gè)甜瓜品種自然發(fā)病的果實(shí)上分離純化出45株病原菌，rDNA-ITS序列比對(duì)分析，分別屬于Fusarium、Penicillium、Alternaria、Aspergillus、Penicillium、Rhizoctonia、Diplodia、Botryotiniafuckeliana等7個(gè)真菌屬，其中Diplodia則是首次在西北甜瓜產(chǎn)區(qū)中國(guó)分離得到的采后病菌，由此說(shuō)明，造成甜瓜采后腐爛變質(zhì)的病原菌種類(lèi)豐富多樣且不斷增加。

樣品的病原菌群落多樣性可用多樣性指數(shù)(香濃-威爾森指數(shù))反映，病原菌種群分布特點(diǎn)的重要指標(biāo)是均勻度指數(shù)，豐富度指數(shù)是反映病原菌種屬豐富性的重要指數(shù)，而兩個(gè)不同品種間病原菌群落組成的相似程度則用相似性系數(shù)反映。本研究對(duì)西州密17號(hào)、金龍和水晶綠甜瓜3個(gè)甜瓜品種的病原菌進(jìn)行分析，從西州密17號(hào)分離到的27株菌分布在5個(gè)屬中，多樣性指數(shù)、豐富度都為最高，分別為0.918、0.683，優(yōu)勢(shì)菌群為Fusarium；從水晶綠甜瓜中分離出11株菌分別屬于Fusarium、Alternaria、Penicillium和Diplodia，多樣性指數(shù)為0.628，豐富度為2.627，F(xiàn)usarium占主要優(yōu)勢(shì)；從金龍中只分離到7株菌，多樣性指數(shù)和豐富度都為最低只有0.438、1.576，Aspergillus較多。從3個(gè)地區(qū)分離到的菌株組成相似度來(lái)分析，3個(gè)品種之間真菌組成雖有不同但是差異不顯著，感染的菌株總體仍以Fusarium為主，由此可見(jiàn)，不同的甜瓜品種采后分離的病原菌數(shù)量、種類(lèi)及群落多樣性水平具有較大差異，但是相似度較低，造成甜瓜采后腐爛變質(zhì)的主要原因是由于多種病原菌的侵染，不同地區(qū)、不同甜瓜品種發(fā)生病害的種類(lèi)有一定的差異。近年來(lái)，隨著甜瓜品種的增加，各地區(qū)栽培模式的不同，采后造成果實(shí)腐敗腐爛的病原菌的多樣性和結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生很大變化，因此，研究不同地區(qū)和不同品種的甜瓜采后病原菌為研究者提供大量的理論基礎(chǔ)，為貯藏和運(yùn)輸中的病害防治具有重要的意義。

4 結(jié) 論

通過(guò)對(duì)室溫條件下貯藏的西州密17號(hào)、金龍、水晶綠甜瓜自然發(fā)病的果實(shí)進(jìn)行病原菌的分離并結(jié)合ITS序列的鑒定，分離到的45個(gè)菌株分別為Fusarium、Aspergillus、Penicillium、Alternaria、Rhizoctonia、Diplodia、Botryotinia7個(gè)屬20個(gè)種，其中引起西州密17號(hào)和水晶綠甜瓜的病原菌以Fusarium為優(yōu)勢(shì)菌群，而從金龍的果實(shí)上分離的Penicillium則較多，由此說(shuō)明不同甜瓜品種受不同病原菌的侵害；通過(guò)對(duì)不同品種的甜瓜采后病害多樣性及病原菌相似性分析，不同的甜瓜品種采后分離的病原菌數(shù)量、種類(lèi)及群落多樣性水平具有較大差異，但是相似度較低，由此來(lái)說(shuō)甜瓜采后腐爛變質(zhì)的主要原因是由于多種病原菌的侵染，不同地區(qū)、不同甜瓜品種發(fā)生病害的種類(lèi)有交叉也有一定的差異。