去細胞化全肝臟生物支架的制備及初步分析

張慶峰，梁志培，李建國，張貴臣，劉軍利，楊士柏

(山東醫(yī)學高等專科學校附屬醫(yī)院，山東 臨沂 276000)

目前，在我國治療肝臟終末期疾病唯一有效的方法就是肝臟移植，但受經濟與供體來源短缺的限制，只有部分患者可以接受到此種療法。為此，積極尋找可以有效替代肝臟功能的產品是臨床所面臨的問題。本文對去細胞化肝臟生物支架(Decellularized liver biological scaffold，DLBS)的制備進行了初步的分析與研究。

1 資料與方法

1.1動物及試劑 試驗動物為30只SD大鼠，體質量250～300 g，雌雄各15只，均由臨沂大學實驗動物中心提供。對大鼠進行等條件喂養(yǎng)，且對其處理符合《關于善待實驗動物的指導性意見》中相關規(guī)則。1%曲拉通X-100(Triton X-100)與胰酶-乙二胺四乙酸均由美國signla公司生產與提供，胎牛血清由杭州四季青生物試劑公司生產，DMEM低糖培養(yǎng)基由美國GIBCO公司生產，表皮生長因子及肝細胞生長因子由美國Peprotech公司提供。

1.2方法

1.2.1DLBS的制備 對大鼠應用0.44 ml、3.6%水合氯醛實施腹腔注射麻醉與開腹，通過門靜脈插管灌注500 ml、0.01 mmol/L磷酸鹽緩沖液(PBS)，5 L、1%Triton X-100，2 L胰酶、0.2 g/L的EDTA，最后利用20LPBS對殘留的Triton X-100進行沖洗，灌注速度要控制在10 ml/min，時間共36 h。將灌注完畢的DLBS儲存在4℃的PBS液中。

1.2.2DLBS的生物學特征鑒定 隨機對DLBS進行多部位的取材，并實施固定、脫水與石蠟包埋，對石蠟實施切片、脫蠟與HE染色。對其膠原纖維的完整性與無細胞核的殘存情況進行觀察。取1.0 cm×0.8 cm大小的DLBS標本，用2.5%戊二醛進行固定，將其保存在4℃的環(huán)境下，應用掃描電鏡進行觀察。

1.2.3DLBS的細胞相容性鑒定 在-20℃條件下，對DLBS實施冰凍切片(厚度1 mm)，將切片懸浮在6孔培養(yǎng)板內，采用Y射線進行照射消毒，將其漂洗浸泡在PBS與DMEM低糖培養(yǎng)基中，持續(xù)l d后，選擇優(yōu)質一代C3A、SD大鼠骨髓間充質干細胞，依據1×105/ml密度[1]，將其接種在貼有支架切片的6孔培養(yǎng)板內進行培養(yǎng)。

1.2.4DLBS對C3A細胞增殖的影響 按照5 ml/cm2，將DLBS放入適量的DMEM培養(yǎng)液(含10%FBS)，將其靜置在37℃的條件下，持續(xù)24 h，制備浸提液，并將其濃度稀釋到50%。將C3A細胞稀釋成l×104個細胞/ml，接種在3塊96孔板上，每板3組，每組5孔，每孔150μl，將其置入5%CO2、37℃的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，將原培養(yǎng)液棄掉。參照組(A)添加10%FBS的DMEM 100 μl，研究組分別添加50%(B)與100%(C)的樣品浸出液，將其保存在培養(yǎng)箱中，最后分別在3、6、9 d各拿出l塊培養(yǎng)樣板，每孔添加5 mg/ml的MTT 20μl，連續(xù)培養(yǎng)4 h，將培養(yǎng)液倒出，加入100μl二甲基亞砜，振蕩10 min，用酶聯免疫檢測儀進行吸收值測試，波長為490 nm。細胞相對增值率(RGR)=實驗組吸光值/對照組吸光值。

1.2.5DLBS組織相容性評價 剪切一塊DLBS組織，將其埋植在另一只SD大鼠背部皮下，埋植2周后將DLBS組織塊取出，實施石蠟包埋切片，利用行H-E染色對其體內炎癥反應與DLBS的免疫源性進行評價。

2 結果

2.1DLBS的制作 30只SD大鼠中，成功28只，失敗2只，成功率為93.33%。由此可知，化學去垢劑和酶聯合制備DLBS成功率較高。

2.2DLBS的組織學觀察 肝臟生物支架包膜完整，外觀透明，肝臟形態(tài)完整，包膜內Glisson系統(tǒng)保存良好，無細胞核殘留，細胞外基質樣結構良好(見封三圖1)。肝臟內無細胞成分與溶解、斷裂情況，且膠原纖維排列整齊(見封三圖2)。

2.3DLBS細胞相容性鑒定 SD大鼠骨髓間充質干細胞密集、黏附在DLBS上，生長情況良好；細胞在DLBS上的生長情況良好，說明DLBS的細胞相容性較好。

2.4DLBS對C3A細胞增殖的影響 B、C組的RGR>1。3組各時間吸光值比較均有統(tǒng)計學意義，兩兩比較顯示：均以C組最高，B組次之，A組最低(q=3.64～29.46；P<0.05)，見表1。

表1 外細胞毒性實驗結果

2.5皮下包埋實驗 組織內出現炎癥細胞浸潤情況較少(見封三圖3)，由此可知，該制備技術去細胞效果明顯，且無免疫與炎癥反應。

3 討論

近年來，隨著我國醫(yī)療技術水平的不斷提高，肝臟組織工程的發(fā)展為終末期肝病的治療提供了新的選擇與治療途徑。研究發(fā)現，天然細胞外基質成分在細胞的發(fā)育、分化、遷移、粘附、增殖、三維空間排列方式等多個方面起到了十分重要的作用。目前，肝臟組織工程面臨的最大的問題與挑戰(zhàn)就是如何有效解決肝細胞組織化培養(yǎng)過程中所需要的氧氣和營養(yǎng)供應等。傳統(tǒng)的合成材料制作過程雖然相對簡單，但卻無法有效滿足肝細胞生長所必須的條件[2-4]。去細胞化支架材料的整體結構與人體內的生長環(huán)境十分相似，從而更利于肝細胞的生長。另外，多項研究表明，去細胞化生物支架材料保留了大量的細胞活性成分，有明顯的促進細胞生長的功能[5-7]。本研究利用化學去垢劑-酶聯合去細胞技術制成的全肝臟生物支架，支架上無細胞成分的殘余，卻完整地保留了血管、膽管等結構，使利用這些管道為細胞提供營養(yǎng)成為可能。

總之，采用化學去垢劑-酶與去細胞化技術制備去細胞化全肝臟生物支架具有較為突出的優(yōu)勢，不僅有效保留支架結構的完整性，具備良好的細胞與組織相容性，同時也能大大減少異體組織的免疫反應，促進其生長，實用性較高。