klotho通過Wnt/β-catenin通路抑制高磷誘導的人主動脈平滑肌鈣化

劉海軍，解修花，楊秀芹，王 瑩，李延國

(1山東醫(yī)學高等?？茖W校，山東 臨沂 276000；2臨沂市人民醫(yī)院)

血管鈣化(Vascular calcification，VC)往往導致較差的臨床結果和較大的心血管疾病風險。在慢性腎臟病(Chronic kidney disease，CKD)患者中，VC被認為是一個主要的心血管危險因素[1]。血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)在VC形成過程中起著關鍵作用，能夠將其收縮表型轉變?yōu)槌晒羌毎统绍浌羌毎麡颖硇蚚2]，其中復雜的細胞內信號通路控制著VSMCs的成骨/成軟骨分化[3]，是許多鈣化抑制因素及鈣化促進因素綜合平衡的結果。Klohto作為一種抗衰老基因在健康人群及疾病患者礦物質及骨代謝過程中發(fā)揮重要作用，其缺乏已經在CKD患者中普遍存在，并被證實直接參與VC的發(fā)展。有研究顯示，klotho在CKD患者中具有預防動脈鈣化和減少動脈僵硬度的作用[4]。但Klotho對VC保護作用的具體機制尚不明確。本研究利用基因轉染的方法，探討Klotho對高磷誘導的人主動脈平滑肌細胞(Human aortic smooth muscle cells，HASMCs)鈣化的保護作用機制。

1 材料與方法

1.1HASMCs的培養(yǎng)及鈣化的誘導 HASMC及其培養(yǎng)基購自ScienCell公司(美國)。將HASMC置于37℃，95% CO2孵箱中孵育，每1～2天換液1次，第3～8代用于本實驗。傳代后的細胞經胰蛋白酶消化后接種于六孔板中，待細胞貼壁后，換成磷濃度分別為1.3 mmol/L(正常磷濃度)、2.6 mmol/L(高磷濃度)的培養(yǎng)基。細胞培養(yǎng)時間為9 d。換用不同培養(yǎng)基的第1天記為第0天。直徑6 cm培養(yǎng)皿中細胞處于對數生長期，生長狀態(tài)良好時即可凍存。離心去上清液后取0.8 ml胎牛血清重懸細胞沉淀，加入80 μl二甲基亞砜混勻，封入凍存管，放入-80℃冰箱保存。

1.2klotho基因轉染 轉染試劑lipofectamine2000及質粒購自美國invitrogen公司。將質粒pcDNA3.1-GFP-KL(含有klotho全長基因序列)通過轉染試劑分別轉染至正常磷濃度和高磷濃度組，轉染48 h，具體操作按說明書進行。

1.3實驗分組 實驗分4組：I組，正常磷濃度組；Ⅱ組，高磷濃度培養(yǎng)組；Ⅲ組，正常磷濃度+klotho轉染組；Ⅳ組，高磷濃度+klotho轉染組。

1.4各組鈣化程度的檢測 茜素紅染色法鑒定細胞的鈣鹽沉積，光鏡下觀察細胞外基質呈現(xiàn)橙色著色、細胞呈淡紫色著色為鈣鹽沉積染色陽性。細胞外基質鈣含量的定量檢測：棄去上層培養(yǎng)基，PBS緩沖液洗滌細胞3次，0.6 mol/L鹽酸去鈣化，37℃脫鈣24 h。收集上清液用鈣離子定量檢測試劑盒(北京中生北控公司)測定鹽酸懸液中的鈣含量。剩余細胞提取細胞總蛋白，BCA蛋白檢測試劑盒法測定蛋白含量。用蛋白含量校正鈣含量(mmol/g)。

1.5指標蛋白的表達 準備細胞，棄掉培養(yǎng)液，預冷PBS浸泡、清洗3次，倒掉PBS，加蛋白裂解液和抗胰蛋白酶，于4℃冰箱15 min，次日超聲裂解。用BCA法測定堿性磷酸酶(ALP)、Runt相關轉錄因子2(Runx2)、骨保護素(OPG)、骨橋蛋白(OPN)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)。電泳分離蛋白，轉膜、封閉后加入一抗(兔抗人單克隆抗體)、二抗(羊抗兔Ig-羅丹明標記二抗)，將ECL發(fā)光液加到膜上，經X膠片曝光顯影，以光掃描儀記錄蛋白印跡的實驗結果。以目的蛋白條帶與GAPDH條帶光密度的比值作為目的蛋白的相對表達量。

2 結果

2.1HASMCs形態(tài) 倒置相差顯微鏡下觀察，正常磷濃度下培養(yǎng)的HASMCs細胞呈梭形或多角形，細胞生長融合后，細胞間平行排列成束或呈放射狀，具備平滑肌細胞生長的“波峰-波谷”樣生長特點，符合VSMC形態(tài)學特征。在熒光顯微鏡下，轉染pcDNA3.1-GFP-KL質粒的HASMCs呈現(xiàn)綠色熒光，證明轉染成功。見封二圖1-3。

2.2茜素紅染色結果 Ⅰ組細胞基質未著色，細胞呈褐色，可見細胞外基質鈣鹽沉積染色不明顯；Ⅱ組細胞外基質呈暗紅色，可見明顯鈣化結節(jié)，細胞仍為褐色，細胞外基質鈣鹽沉積染色陽性。與Ⅱ組相比，Ⅳ組細胞外基質中有鈣鹽沉積，其程度較Ⅱ組輕；Ⅲ組細胞外基質鈣鹽幾乎無沉積，未見著色。見封二圖4-7。

2.3細胞外基質鈣含量測定結果 Ⅰ組：(1.22±0.19) mmol/g；Ⅱ組：(1.86±0.04) mmol/g；Ⅲ組：(1.21±0.19) mmol/g；Ⅳ組：(1.63±0.04) mmol/g。4組比較有統(tǒng)計學意義(F=11.32，P<0.01)。兩兩比較顯示：Ⅱ組含量明顯高于其他各組(P<0.05)；Ⅰ組與Ⅲ組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.4Western blot結果 各組相關指標均有統(tǒng)計學意義。兩兩比較顯示：Ⅱ組ALP、Runx2及β-catenin蛋白表達最高(P<0.05)，OPG及OPN蛋白表達最低(P<0.05)；Ⅰ組與Ⅲ組各蛋白表達無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表1、封二圖8。

表1 各組指標蛋白的表達

3 討論

高磷血癥是CKD患者的常見臨床特征，與動脈中層鈣化的發(fā)生發(fā)展密切相關，被認為是與心血管發(fā)病率和死亡率密切相關的主要危險因素[5]。高磷誘導的VC是一種由VSMCs的成骨/軟骨分化促進的病理過程。VSMCs暴露于高磷酸鹽環(huán)境中，類似于CKD患者的病理生理狀態(tài)，已被證明可通過調節(jié)骨基質在血管壁的沉積過程啟動其向外轉分化成骨樣細胞。本研究利用高磷誘導HASMCs的成骨細胞鈣化及轉分化，結果顯示：細胞外基質呈暗紅色，可見明顯鈣化結節(jié)，細胞仍為褐色，細胞外基質鈣鹽沉積染色陽性，細胞外基質鈣含量明顯升高，且高磷培養(yǎng)組ALP蛋白表達明顯升高，符合VC的生物學特點。

許多因素已被證明對骨形成是至關重要的，其中Runx2和Wnt/β-catenin信號尤為重要，因為它們是成骨細胞分化啟動所必需的通路的功能連接元件。Wnt/β-catenin信號已被證實參與高磷酸鹽誘導的VSMCs成骨轉分化和動脈中膜鈣化的發(fā)展[6]。Runx2是一個關鍵的成骨細胞轉錄因子，對軟骨細胞的成熟和成骨分化至關重要。它最初被認為只在骨骼發(fā)育過程中表達，現(xiàn)在已知它在鈣化發(fā)育過程中在血管內膜和血管內側被激活。Runx2的表達由Wnt信號通路通過人T細胞/淋巴細胞增強因子協(xié)同轉錄因子的直接結合來調控[7]。Wnt通路激活規(guī)范的途徑的特征是細胞質中的β-Catenin的積累和隨后的核易位。本研究結果顯示：高磷培養(yǎng)組Runx2和β-catenin蛋白表達明顯升高；給予klotho基因轉染后，Runx2和β-catenin蛋白表達顯著下降，且高磷+klotho基因轉染組鈣化程度明顯減輕，細胞外基質鈣含量明顯減少。提示klotho通過影響Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮了抑制HASMCs鈣化的作用。

OPN是一種富含唾液酸的分泌型磷酸化糖蛋白，在體內廣泛表達，在VSMCs和動脈內皮細胞中表達尤其高，是VC的重要抑制因子。研究發(fā)現(xiàn)，體外培養(yǎng)的高磷、高鈣濃度培養(yǎng)基中，HASMCs的OPN mRNA及OPN蛋白表達均明顯增加[8]。OPG缺乏的小鼠骨質疏松癥和血管鈣化均增加，其水平與血液透析患者VC相關[9]。本研究結果顯示：高磷濃度培養(yǎng)的HASMCs細胞中OPN及OPG蛋白表達均減少，而高磷濃度+Klotho基因轉染組OPN及OPG蛋白表達均顯著增加。提示OPN及OPG蛋白是高磷誘導HASMCs轉分化和鈣化的抑制因子，對VC的發(fā)生具有保護性作用。但其具體機制仍然需要進一步研究。

綜上所述，高磷誘導VSMCs發(fā)生鈣化是一個涉及到多種細胞因子的活性過程。Klotho基因轉染能夠降低高磷誘導的HASMCs鈣化，其作用機制可能與下調Wnt/β-catenin信號通路導致OPG、OPN蛋白表達增加有關。應用外源性的Klotho或者影響Klotho表達的調節(jié)劑有望成為臨床預防和治療VC的一個靶點。