載脂蛋白C3轉(zhuǎn)基因小鼠應(yīng)用于嚴(yán)重高三酰甘油血癥急性胰腺炎的探索

柳 鑫 徐有青 崔純瑩 趙志剛*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院藥學(xué)部，北京 100070； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院消化內(nèi)科，北京 100070；3.首都醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥劑學(xué)系，北京 100069)

急性胰腺炎是由于胰蛋白酶原過度激活，胰蛋白酶生成增加，引起胰腺自我消化的一種急性炎性反應(yīng)[1]。流行病學(xué)調(diào)查研究[2]顯示，繼膽道疾病與乙醇中毒因素外，嚴(yán)重高三酰甘油(triglyceride,TG)血癥已成為急性胰腺炎的第三發(fā)病因素。嚴(yán)重高三酰甘油血癥急性胰腺炎的發(fā)病機(jī)制尚不明確，主要原因在于缺少合適的嚴(yán)重高三酰甘油血癥動(dòng)物模型[3-5]。

通過高脂飲食誘導(dǎo)動(dòng)物，血漿三酰甘油濃度只能增加2～3倍，采用腹腔注射TritonWR1339抑制脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)活性，可使血漿三酰甘油濃度增加5～10倍，但是急性效應(yīng)較短暫，且對動(dòng)物應(yīng)激狀態(tài)影響很大。早期有使用LPL基因敲除小鼠探討嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎易感性的報(bào)道[4]，但由于LPL基因敲除小鼠的新生期致死性，救治存活率極低，該模型應(yīng)用于嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎的病理機(jī)制研究非常困難，經(jīng)濟(jì)成本也很高。為了探索嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎的病理機(jī)制，需要使用易于繁殖的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小鼠模型。

載脂蛋白C3(apolipoprotein C3，ApoC3)是由肝臟和小腸合成的一種載脂蛋白，ApoC3除了能夠抑制LPL水解三酰甘油，還能抑制肝臟攝取乳糜微粒、極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein，VLDL)及其殘?bào)w脂蛋白，引起血漿三酰甘油濃度升高[1]。在三酰甘油代謝中，過表達(dá)ApoC3基因，能夠引起血漿三酰甘油濃度極度升高。ApoC3基因發(fā)生突變后，可導(dǎo)致血漿三酰甘油濃度降低，與動(dòng)脈粥樣硬化心血管風(fēng)險(xiǎn)下降有直接相關(guān)性[6-7]。

為了驗(yàn)證過表達(dá)人ApoC3基因的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小鼠是否也發(fā)生急性胰腺炎，使用人ApoC3轉(zhuǎn)基因(ApoC3 transgenic，ApoC3tg)的小鼠模型，使用雨蛙素(caerulein)誘導(dǎo)急性胰腺炎后，與野生型小鼠比較，ApoC3tg小鼠表現(xiàn)出嚴(yán)重高三酰甘油血癥，胰腺病理損傷加重，使用抗氧化劑叔丁基-特丁基對苯二酚(tertiary-butylhydroquinone, tBHQ)預(yù)防性給藥，并不能使胰腺病理損傷得到改善。

1 材料與方法

1.1 試劑

Caerulein購自美國Sigma公司，tBHQ由北京大學(xué)藥學(xué)院余四旺老師贈(zèng)送，生物化學(xué)檢測試劑盒(淀粉酶活性試劑盒、三酰甘油試劑盒、總膽固醇試劑盒與血糖試劑盒)均購自北京中生北控生物科技公司。

1.2 小鼠分組與基因型鑒定

ApoC3tg小鼠由美國Jackson實(shí)驗(yàn)室提供，采用同窩對照野生型小鼠。所用小鼠均為C57BL/6J背景下8周齡雄性小鼠(LA2010-059)，實(shí)驗(yàn)分為兩組：野生型(wild type，WT)、ApoC3tg小鼠，每組6只，提取鼠尾DNA，采用PCR鑒定基因型。所采用的引物詳見表1。

表1 基因型鑒定的引物序列

ApoC3tg: apolipoprotein C3 transgenic.

1.3 血脂測定

自小鼠眶靜脈采血，取上層血漿，利用生物化學(xué)檢測試劑盒測定野生型小鼠與ApoC3tg小鼠的血漿TG、總膽固醇(total cholesterol,TC)和血糖(glucose,Glu)。

1.4 急性胰腺炎誘導(dǎo)

每組小鼠自由飲水，禁食12 h，采用雨蛙素(caerulein)誘導(dǎo)胰腺炎，按50 μg/kg腹腔注射給藥，1次/h，連續(xù)注射7次，第一次腹腔注射24 h 后處死小鼠，心臟灌流，提取胰腺組織，用于病理學(xué)分析。

1.5 血漿淀粉酶活性檢測

肝素抗凝后眶靜脈采血，4 °C，12 000 r/min，離心60 min，吸取3 μL下層澄清液體，加入96孔板中，吸取100 μL淀粉酶工作液，37 °C恒溫孵育3 min，按多點(diǎn)法設(shè)置酶標(biāo)儀參數(shù)，在605 nm波長處讀取1、2、3 min 末的A值，血漿淀粉酶活性(U/L)=[A(3 min)-A(1 min)]/2×3 245×稀釋倍數(shù)，當(dāng)[A(3 min)-A(1 min)]/2>0.3時(shí)，用ddH2O稀釋樣品后測定。

1.6 胰腺組織染色與病理評估

胰腺組織在25%～100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇中，分別浸泡10 min，脫水，采用二甲苯浸泡至組織透明，加入熔化好的石蠟，60 ℃下保溫30 min，石蠟切片厚度為6 μm，采用二甲苯脫蠟，無水乙醇洗脫二甲苯，分別使用蘇木精與伊紅染色1 min，二甲苯洗脫處理后，中性樹膠封片，采集圖像，進(jìn)行胰腺組織病理學(xué)評分，炎性細(xì)胞數(shù)量取10個(gè)，400×放大視野的平均值，實(shí)質(zhì)細(xì)胞壞死與空泡化水平以腺泡細(xì)胞壞死和空泡百分比來衡量(表2)。

1.7 抗氧化劑tBHQ對ApoC3tg小鼠淀粉酶活性與胰腺病理損傷的影響

為了觀察氧化應(yīng)激在嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎中的作用，ApoC3tg小鼠灌胃給予不同劑量抗氧化藥物tBHQ，對照組給予空白溶劑聚乙二醇，7 d后采用上述方法誘導(dǎo)急性胰腺炎。

表2 胰腺組織病理評分標(biāo)準(zhǔn)

圖2 ApoC3tg小鼠血漿脂質(zhì)濃度升高

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 ApoC3tg小鼠血脂升高

ApoC3tg小鼠基因鑒定如圖1所示，與野生小鼠相比，ApoC3tg小鼠體質(zhì)量與血糖濃度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A、B)，血漿三酰甘油明顯升高(圖2C)，總膽固醇含量伴隨三酰甘油升高而升高(圖2D)。

圖1 ApoC3基因型小鼠在60 bp處有明亮條帶

2.2 ApoC3tg小鼠血漿淀粉酶活性在9 h與12 h時(shí)明顯升高

ApoC3tg小鼠與野生型小鼠的血漿淀粉酶活性，隨時(shí)間發(fā)生顯著變化(F=28.576，P=0.001)，在誘導(dǎo)胰腺炎后9 h與12 h時(shí)明顯升高，兩組之間的血漿淀粉酶活性差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.001，P=0.979),詳見圖3。

圖3 不同時(shí)間點(diǎn)下的血漿淀粉酶活性變化

2.3 ApoC3tg小鼠胰腺病理損傷加重

與野生型小鼠相比，ApoC3tg小鼠胰腺組織水腫加重，小葉間與內(nèi)部間隙增寬，結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間有大量炎性細(xì)胞浸潤(圖4)，分別對胰腺組織水腫與炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)進(jìn)行病理學(xué)評分(表3)，ApoC3tg小鼠胰腺組織的病理評分顯著高于野生小鼠，表明ApoC3tg小鼠的胰腺炎性反應(yīng)加重，對雨蛙素誘導(dǎo)的急性胰腺炎更加敏感。

圖4 ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠胰腺病理損傷顯著加重

2.4 抗氧化劑tBHQ沒有改變ApoC3tg小鼠的血漿淀粉酶活性與胰腺病理

隨著時(shí)間變化，血漿淀粉酶活性發(fā)生明顯改變(F=45.120，P=0.001)，分組之間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=2.050，P=0.185)(圖5)。

胰腺組織病理切片HE染色結(jié)果(圖6)顯示，與對照組小鼠相比，低、中或高劑量的tBHQ均未見胰腺病理損傷得到改善，對胰腺組織水腫與炎細(xì)胞浸潤指標(biāo)進(jìn)行病理評分(表4)，tBHQ 50、 100、 200 mg/kg給藥組ApoC3tg小鼠的胰腺組織水腫沒有減輕，小葉間與內(nèi)部間隙沒有縮小，小葉間炎性細(xì)胞浸潤沒有減輕。

表3 ApoC3tg小鼠胰腺組織病理學(xué)評分

GroupWTApoC3tgtPEdema2.8±0.845.4±1.52*2.7460.025Inflammatory infiltration2.6±0.554.6±1.14*4.1740.033

*P<0.05vsWT；WT: wild type；ApoC3tg: apolipoprotein C3 transgenic；n=6.

圖5 不同劑量抗氧化藥物tBHQ對ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠血漿淀粉酶活性的影響

圖6 不同劑量抗氧化藥物tBHQ沒有改善ApoC3tg小鼠的胰腺損傷

表4 tBHQ用藥后ApoC3tg小鼠胰腺組織病理評分

n=6;tBHQ： terbiary-butylhydroquinone；ApoC3tg: apolipoprotein C3 transgenic.

3 討論

本研究顯示，ApoC3轉(zhuǎn)基因小鼠血漿三酰甘油濃度明顯升高，使用雨蛙素誘導(dǎo)急性胰腺炎后，血漿淀粉酶活性在9 h與12 h均升高，胰腺病理損傷加重，具體表現(xiàn)為水腫加重，小葉間與內(nèi)部間隙增寬，結(jié)構(gòu)紊亂，小葉間有大量炎性細(xì)胞浸潤，給予抗氧化劑tBHQ后，未見淀粉酶活性改變與胰腺病理損傷的改善。

流行病學(xué)調(diào)查研究[8-9]顯示，我國高三酰甘油血癥患病率約為高膽固醇血癥的4倍，高三酰甘油血癥除了作為心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，其誘發(fā)急性胰腺炎的危險(xiǎn)性越來越受到臨床關(guān)注。早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也顯示自發(fā)性嚴(yán)重高三酰甘油血癥動(dòng)物L(fēng)PL基因突變的水貂，可出現(xiàn)自發(fā)性急性胰腺炎，但其僅存在于挪威[10-11]。LPL基因突變的小鼠雖然可以通過救治進(jìn)行高三酰甘油血癥急性胰腺炎研究，但國外報(bào)道[12]通過基因治療救治存活率很低。因此，以上研究采用的動(dòng)物模型有很大的局限性。

高三酰甘油血癥急性胰腺炎有典型的急性發(fā)作或反復(fù)急性發(fā)作特點(diǎn)，部分患者出現(xiàn)反復(fù)腹痛癥狀，與非高三酰甘油血癥胰腺炎相比，高三酰甘油血癥急性胰腺炎患者早期容易出現(xiàn)血鈣降低、血鈉降低、低蛋白血癥以及結(jié)腸中斷征等主要臨床表征[13]。三酰甘油受進(jìn)食狀態(tài)影響，在中等程度(177～885 mg/dL，2～10 mmol/L)的高三酰甘油血癥狀態(tài)下也會(huì)引起急性胰腺炎發(fā)作[14]。高三酰甘油血癥引起急性胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展機(jī)制目前尚不明確，推測其可能有以下三種機(jī)制[15-16]。 ① 脂肪酸學(xué)說：三酰甘油的分解產(chǎn)物游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)產(chǎn)生過多，在胰腺內(nèi)不斷聚集，使胰腺腺泡細(xì)胞和較小血管受損，導(dǎo)致急性胰腺炎的發(fā)生與加重[17]，而FFA誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞受損的機(jī)制可能有以下幾種情況：FFA增多引起胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)酸堿度下降，胰蛋白酶原激活，進(jìn)而導(dǎo)致胰腺腺泡細(xì)胞自身消化[18]。② 胰腺微循環(huán)障礙：胰腺微循環(huán)障礙在急性胰腺炎的發(fā)生與病程發(fā)展中起重要作用，在急性胰腺炎的發(fā)病過程中，微循環(huán)障礙會(huì)影響胰腺的血流灌注，從而加重急性胰腺炎[19]，高三酰甘油血癥患者血漿中，大顆粒的乳糜微粒會(huì)使胰腺內(nèi)毛細(xì)血管發(fā)生栓塞，引起微循環(huán)障礙，從而導(dǎo)致胰腺缺血與壞死[20]。③ 氧化應(yīng)激學(xué)說：在胰腺炎發(fā)病的初始階段，氧化應(yīng)激狀態(tài)下產(chǎn)生氧自由基，一方面直接損傷DNA，引起蛋白質(zhì)內(nèi)巰基氧化直接損傷胰腺細(xì)胞[21]，另一方面氧自由基的過氧化物與其他炎性介質(zhì)協(xié)同作用，加重炎性反應(yīng)，降低細(xì)胞膜穩(wěn)定性，使胰腺腺泡細(xì)胞溶酶體酶釋放和消化酶活化[22]。

為了探討臨床上常見的嚴(yán)重高三酰甘油血癥與急性胰腺炎的關(guān)系，筆者采用ApoC3轉(zhuǎn)基因的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小鼠，結(jié)果表明，與LPL基因敲除小鼠相似，嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎的ApoC3tg小鼠胰腺損傷明顯，表明嚴(yán)重高三酰甘油血癥下急性胰腺炎易感性增高。腹腔注射雨蛙素誘導(dǎo)急性胰腺炎后，ApoC3tg小鼠與野生小鼠的血漿淀粉酶活性均在不同時(shí)間點(diǎn)(9 h與12 h)明顯升高，但兩種小鼠的血漿淀粉酶活性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在臨床中也常見報(bào)道[23-24]，和其他急性胰腺炎患者不同，嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎患者的血漿淀粉酶活性并不是一個(gè)靈敏的生物標(biāo)志物，對于臨床診療意義不大。本結(jié)果顯示，在嚴(yán)重高三酰甘油血癥動(dòng)物模型上，血漿淀粉酶同樣不是反映胰腺病理嚴(yán)重程度的靈敏的生物標(biāo)識物。

早期有學(xué)者使用LPL基因敲除小鼠，對嚴(yán)重高三酰甘油血癥與急性胰腺炎的關(guān)系進(jìn)行了初步探索，發(fā)現(xiàn)LPL基因敲除小鼠體內(nèi)乳糜微粒與游離脂肪酸含量明顯升高，導(dǎo)致胰腺細(xì)胞受損，同時(shí)胰脂肪酶水解乳糜微粒，抑制鈣離子進(jìn)入腺泡細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)嚴(yán)重高三酰甘油血癥下胰腺病理損傷[25]。LPL敲除小鼠的血漿丙二醛明顯高于野生型小鼠，而分離出的乳糜微粒氧化程度和年齡成正比，說明這一動(dòng)物氧化應(yīng)激易感性增高，并且因?yàn)檠趸瘬p傷導(dǎo)致自發(fā)性動(dòng)脈硬化的發(fā)生[26]。這些數(shù)據(jù)提示，LPL基因敲除小鼠對胰腺炎易感性增高和發(fā)生自發(fā)性胰腺炎有可能與氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。

抗氧化劑tBHQ作為核轉(zhuǎn)錄因子Nrf2的激動(dòng)劑，能通過上調(diào)血紅素加氧酶-1、超氧化物歧化酶等氧化應(yīng)激因子，對多種炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激有改善作用[27-28]。因此，使用tBHQ對ApoC3tg小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)性預(yù)防給藥，未發(fā)現(xiàn)其對嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎有明顯改善作用，除了tBHQ，筆者也曾使用其他抗氧化劑(二叔丁基對甲酚與普羅布考等)對嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎進(jìn)行干預(yù)，均未見胰腺病理損傷的改善(文章尚未發(fā)表)。由此推測，氧化應(yīng)激可能并非ApoC3tg小鼠在嚴(yán)重高三酰甘油血癥下急性胰腺炎易感性增高的誘導(dǎo)機(jī)制。

本研究使用過表達(dá)人ApoC3基因的嚴(yán)重高三酰甘油血癥小鼠，誘導(dǎo)急性胰腺炎后，符合臨床嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎患者的特點(diǎn)，可以作為理想的研究嚴(yán)重高三酰甘油血癥動(dòng)物模型探討急性胰腺炎發(fā)病機(jī)制。使用基因修飾的高三酰甘油血癥動(dòng)物模型，探討嚴(yán)重高三酰甘油血癥狀態(tài)下急性胰腺炎發(fā)生與發(fā)展機(jī)制，對嚴(yán)重高三酰甘油血癥-急性胰腺炎的診斷與治療，以及藥物的有效性評估，具有一定的理論意義與實(shí)用價(jià)值。