疊氮溴化丙錠-羥基萘酚藍(lán)-環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法檢測畜禽肉中單核細(xì)胞李斯特菌

戴小芳　陳瓊　董華夏　向春燕　虞偉明　酈娟

摘 要：將疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）、羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue，HNB）與環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術(shù)相結(jié)合，建立一種可視化PMA-HNB-LAMP方法快速檢測畜禽肉中單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）。結(jié)果表明，當(dāng)PMA終質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL、孵育和曝光時(shí)間均為15 min時(shí)，可有效抑制105 CFU/mL的單核細(xì)胞李斯特菌死菌DNA的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，而對(duì)活菌DNA的擴(kuò)增不具有抑制作用。LAMP反應(yīng)體系中HNB終濃度為210 μmol/L時(shí)，檢測顯色結(jié)果肉眼可見。該方法的純菌液靈敏度為2.4×102 CFU/mL，人工污染肉制品的檢出限為2.3×104 CFU/ mL。分別采用國標(biāo)法、PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法檢測20 份市售畜禽肉樣，3 種方法的單核細(xì)胞李斯特菌檢出率分別為5%、10%和20%。PMA-HNB-LAMP法在一定程度上可解決LAMP法的假陽性問題，并且具有操作簡單、可視性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。

關(guān)鍵詞：單核細(xì)胞李斯特菌;疊氮溴化丙錠;羥基萘酚藍(lán);環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增;畜禽肉

Abstract： Using propidium monoazide （PMA） treatment and hydroxynaphthol blue （HNB） staining combined with loop-mediated isothermal amplification， a rapid and visual detection method （PMA-HNB-LAMP） for Listeria monocytogenes was established in this study. The optimization of experimental parameters showed that a final PMA concentration of 5.0 μg/mL，?incubation time of 15 min and exposure time of 15 min could restrain DNA amplification of 105 CFU/mL dead cells but not of live cells. A final HNB concentration of 210 μmol/L could give results visible to the naked eyes. The sensitivity of the PMA-HNB-LAMP method was 2.4 × 102 CFU/mL for pure bacterial culture. The detection limit for artificially contaminated meat was?2.3 × 104 CFU/mL. Using the national standard method， PMA-HNB-LAMP and HNB-LAMP， the detection rates of L. monocytogenes in 20 meat products available on the market were 5%， 10% and 20%， respectively. PMA-HNB-LAMP is superior to traditional LAMP in avoiding false-positive results to a certain extent， and it has the advantages of simple operation and strong visibility.

Keywords： Listeria monocytogenes; propidium monoazide; hydroxynaphthol blue; loop-mediated isothermal amplification; poultry and livestock meat

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20200113-009

中圖分類號(hào)：TS251.7? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2020）05-0048-05

單核細(xì)胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）是一種人畜共患病致病菌，該菌可引起腦膜炎、敗血癥、孕婦流產(chǎn)等[1-2]。單核細(xì)胞李斯特菌在-4～45 ℃的環(huán)境下均能生存，肉及肉制品是其主要污染源[3-4]。單核細(xì)胞李斯特菌的傳統(tǒng)微生物檢測方法需要經(jīng)過培養(yǎng)、分離和生化鑒定，時(shí)間一般為5～7 d[5]，這并不能滿足生產(chǎn)過程中品質(zhì)控制檢測時(shí)的限性要求，因此建立單核細(xì)胞李斯特菌的快速檢測方法顯得尤為重要。

單核細(xì)胞李斯特菌的快速檢測方法主要包括基于DNA水平的實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法[6-7]、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）法[8-9]、重組酶聚合酶擴(kuò)增（recombinase polymerase amplification，RPA）法[10]和數(shù)字PCR法[11]等，以及處于蛋白質(zhì)水平的基于免疫機(jī)制的方法[12-13]。LAMP技術(shù)由于不需要高溫變性、退火等步驟，因此在恒溫條件下就可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA的高效擴(kuò)增，與PCR、定量PCR等技術(shù)在快速檢測場景中相比，具有簡便、快捷且無需昂貴的熱循環(huán)設(shè)備等優(yōu)勢(shì)，是目前廣泛使用的恒溫核酸擴(kuò)增技術(shù)之一[14-15]。

傳統(tǒng)的LAMP法仍存在一些不足。一方面，結(jié)果可視性不強(qiáng)。雖然LAMP反應(yīng)后會(huì)產(chǎn)生焦磷酸鎂沉淀，并在定性檢測時(shí)可用肉眼直接觀察結(jié)果，但當(dāng)?shù)涂截惖哪０宕嬖跁r(shí)焦磷酸鎂沉淀產(chǎn)生較少，肉眼判斷困難。目前通常將LAMP反應(yīng)與凝膠電泳或濁度儀結(jié)合[16-17]，或者在反應(yīng)體系中加入熒光染料通過儀器進(jìn)行判讀[18]，但這些改進(jìn)措施都需要借助儀器。另一方面，LAMP等基于DNA擴(kuò)增的檢測方法難以區(qū)分樣品中的“死菌”與“活菌”，因此易造成假陽性結(jié)果[19]。

羥基萘酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue，HNB）是一種金屬離子指示劑[20]，在LAMP反應(yīng)前添加HNB，反應(yīng)后的陰性管會(huì)呈紫羅蘭色，陽性管呈天藍(lán)色，因此可用于增強(qiáng)LAMP檢測結(jié)果的可視性。HNB-LAMP法檢測單核細(xì)胞李斯特菌，結(jié)果判定快速、直觀和簡便[21-22]。

疊氮溴化丙錠（propidium monoazide，PMA）聯(lián)合LAMP技術(shù)可選擇性抑制死菌細(xì)胞DNA擴(kuò)增[23-24]。Zhong Qingping等[25]運(yùn)用PMA-LAMP技術(shù)檢測金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus），結(jié)果表明運(yùn)用PMA-LAMP技術(shù)能在不受死細(xì)胞和其他細(xì)菌干擾的情況下檢測金黃色葡萄球菌的活的但非可培養(yǎng)狀態(tài)細(xì)胞。馬骉等[26]建立PMA-LAMP法檢測副溶血性弧菌（Vibrio parahemolyticus），結(jié)果表明PMA-LAMP法可有效剔除死細(xì)胞和其他細(xì)菌干擾。Kragh等[27]用PMA-PCR法研究熱處理和干燥處理后的單核細(xì)胞李斯特菌活菌，結(jié)果表明PMA對(duì)活細(xì)胞檢測至關(guān)重要。本研究將PMA、HNB和LAMP技術(shù)結(jié)合，建立操作簡單、設(shè)備要求低、結(jié)果判定直觀的單核細(xì)胞李斯特菌活菌的可視化PMA-HNB-LAMP檢測方法，并將其用于畜禽肉中單核細(xì)胞李斯特菌的檢測，為食品企業(yè)在生產(chǎn)經(jīng)營環(huán)節(jié)品質(zhì)控制和病原菌現(xiàn)場檢測中提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

單核細(xì)胞李斯特菌ATCC 19115、單核細(xì)胞李斯特菌分離株（B60、B62）、英諾克李斯特菌（Listeria innocua）ATCC 33090、伊氏李斯特菌（Listeria ivanovii）ATCC 19119、鼠傷寒沙門氏菌（Salmonella typhimurium）ATCC 14028、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538、表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）ATCC 12228、阪崎腸桿菌（Enterobacter sakazakii）ATCC 51329、熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）FSCC 206546、大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 25922、副溶血性弧菌FSCC 232009、銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）FSCC 206003，所用標(biāo)準(zhǔn)菌株均購自美國典型菌種保藏中心，單核細(xì)胞李斯特菌分離株來自生雞肉中檢出的單核細(xì)胞李斯特菌陽性菌，-80 ℃保存于實(shí)驗(yàn)室。

單核細(xì)胞李斯特菌增菌肉湯（LB1）、胰酪胨大豆瓊脂（含0.6%酵母浸膏）、PALCAM瓊脂、單核細(xì)胞李斯特菌顯色培養(yǎng)基、營養(yǎng)肉湯 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司;Bst DNA聚合酶 New England Biolab公司;甜菜堿 美國Sigma公司;dNTPs、LAMP引物 生工生物工程（上海）股份有限公司;HNB（分析純） 上海麥克林生化科技有限公司;PMA 美國Biotium公司;細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司;單核細(xì)胞李斯特菌免核酸提取核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法） 卡尤迪生物科技（北京）有限公司;可視化單核細(xì)胞李斯特菌核酸快速檢測試劑盒 廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

WNB-45恒溫水浴箱 德國美墨爾特公司;A2生物安全柜 賽默飛世爾科技（中國）有限公司;CFX96 TOUCH-實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA模板的制備

將-80 ℃保存的單核細(xì)胞李斯特菌活化后接種到LB1增菌液中，30 ℃培養(yǎng)24 h，以此為菌原液。吸取1 mL菌原液加入9 mL無菌生理鹽水中制成1∶10菌液，充分混勻后吸取1 mL菌液到9 mL無菌生理鹽水中制成1∶100菌液，重復(fù)上述步驟制成10 倍系列梯度稀釋菌液，用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取各梯度稀釋菌液制備DNA模板，同時(shí)采用平板計(jì)數(shù)法對(duì)各梯度稀釋菌液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2 死菌的制備

采用高溫煮沸法制備死菌用于PMA處理。將上述各梯度單核細(xì)胞李斯特菌稀釋菌液于100 ℃加熱10 min，作為死菌液。在30 ℃培養(yǎng)48 h以上進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，以確保無活菌生長。

1.3.3 PMA處理的優(yōu)化

參考文獻(xiàn)[28-29]進(jìn)行PMA處理，將單核細(xì)胞李斯特菌死菌液菌體濃度調(diào)整為105 CFU/mL，分別加入質(zhì)量濃度5、10、20、30、40、50 ?g/mL的PMA，室溫避光孵育15 min后，LED藍(lán)光儀曝光15 min。按照試劑盒說明書進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定能夠抑制105 CFU/mL單核細(xì)胞李斯特菌死菌DNA擴(kuò)增的PMA質(zhì)量濃度范圍。在該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，對(duì)單核細(xì)胞李斯特菌活菌（菌體濃度103～105 CFU/mL）進(jìn)行PMA處理，確定對(duì)死菌DNA擴(kuò)增抑制效率最高但不能抑制活菌DNA擴(kuò)增的PMA質(zhì)量濃度。

1.3.4 LAMP反應(yīng)體系的建立

采用SN/T 2754.4—2011《出口食品中致病菌環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增（LAMP）檢測方法 第4部分：單核細(xì)胞增生李斯特菌》中的反應(yīng)體系[30]。反應(yīng)體系體積25 ?L，包括1.6 mmol/L dNTPs 4 ?L、8.0 mmol/L MgSO4溶液1 ?L、1.6 ?mol/L FIP引物1 ?L、1.6 ?mol/L BIP引物1 ?L、0.2 ?mol/L F3引物0.5 ?L、0.2 ?mol/L B3引物0.5 ?L、0.8 mol/L甜菜堿4 ?L、0.16 U/?L Bst DNA聚合酶0.5 ?L、1×ThermoPol 2.5 ?L、DNA模板2.5 ?L、去離子水7.5 ?L。引物序列如表1所示。

1.3.5 HNB濃度的優(yōu)化

取1 mL菌體濃度107 CFU/mL菌液提取DNA，以超純水作空白對(duì)照。在建立的反應(yīng)體系中分別添加終濃度為240、210、180、150、120、90、60、30 ?mol/L的HNB，按照1.3.4節(jié)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，通過肉眼觀察反應(yīng)結(jié)果。陽性為天藍(lán)色，陰性為紫羅蘭色，以顏色差別明顯、利于觀察為標(biāo)準(zhǔn)確定最適宜HNB濃度。

1.3.6 HNB-LAMP法檢測單核細(xì)胞李斯特菌的特異性與靈敏度分析

按照1.3.1節(jié)方法分別提取各受試菌株DNA，在上述優(yōu)化的HNB-LAMP反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，驗(yàn)證其特異性。將制備的10 倍系列單核細(xì)胞李斯特菌稀釋菌液的DNA模板按照前文建立的HNB-LAMP反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增，進(jìn)行靈敏度分析。

1.3.7 肉制品中單核細(xì)胞李斯特菌的檢出限分析

取25 g火腿腸（已檢測未污染目標(biāo)菌）加入225 mL無菌LB1中，均質(zhì)2 min，制備樣品勻漿。分別取1 mL 10 倍系列梯度稀釋菌液加入9 mL樣品勻漿中，混勻，平板計(jì)數(shù)法確定實(shí)際菌落數(shù)。提取樣品勻漿中目標(biāo)菌模板DNA，在優(yōu)化的HNB-LAMP反應(yīng)體系中進(jìn)行擴(kuò)增，確定檢出限。

1.3.7 PMA-HNB-LAMP法檢測人工污染單核細(xì)胞李斯特菌樣品和實(shí)際冷凍畜禽肉樣品

從市售熟肉制品中選取2 個(gè)樣品（已檢測未污染目標(biāo)菌）制備樣品勻漿，分別人工污染約105 CFU/mL單核細(xì)胞李斯特菌活菌和死菌。按照GB 4789.30—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 單核細(xì)胞增生李斯特氏菌檢驗(yàn)》、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法分別進(jìn)行檢測。PMA-HNB-LAMP法和HNB-LAMP法直接取人工污染的樣品勻漿，提取DNA進(jìn)行后續(xù)檢測。國家標(biāo)準(zhǔn)方法檢測時(shí)需將人工污染樣品勻漿，于30 ℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行后續(xù)檢測。隨機(jī)選取市售冷凍畜肉和冷凍禽肉樣品各10 份，按上述方法進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 PMA處理法的優(yōu)化結(jié)果

1～7. PMA質(zhì)量濃度分別為0、5、10、20、30、40、50 ?g/mL。

由圖1可知，質(zhì)量濃度5～50 ?g/mL的PMA處理105 CFU/mL的單核細(xì)胞李斯特菌死菌后，實(shí)時(shí)PCR擴(kuò)增結(jié)果表明，各質(zhì)量濃度的PMA處理組均能完全抑制105 CFU/mL單核細(xì)胞李斯特菌死菌DNA擴(kuò)增。

1～9. PMA質(zhì)量濃度/（μg/mL）/活菌濃度/（CFU/mL）分別為0/103、0/104、0/105、5/103、5/104、5/105、10/103、10/104、10/105。

以質(zhì)量濃度5、10 ?g/mL的PMA分別處理菌體濃度103、104、105 CFU/mL的單核細(xì)胞李斯特菌活菌菌液。由圖2可知：5 ?g/mL PMA處理不能抑制單核細(xì)胞李斯特菌活菌的DNA擴(kuò)增;10 ?g/mL PMA處理能夠抑制菌體濃度為103 CFU/mL單核細(xì)胞李斯特菌活菌的DNA擴(kuò)增，但菌體濃度（104、105 CFU/mL）較高時(shí)，不具有抑制作用。最終確定單核細(xì)胞李斯特菌的PMA處理最佳參數(shù)為室溫避光孵育15 min、曝光15 min、PMA質(zhì)量濃度5 ?g/mL。

2.2 可視化HNB-LAMP反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果

1. 單核細(xì)胞李斯特菌;2. 空白對(duì)照組。A～H. HNB濃度分別為30、60、90、120、150、180、210、240 ?mol/L。

由圖3可知，HNB濃度為180～240 ?mol/L時(shí)，陰性反應(yīng)管（空白對(duì)照組）與陽性反應(yīng)管顏色對(duì)比明顯。因此，選擇HNB濃度210 ?mol/L。

2.3 可視化HNB-LAMP法的特異性與靈敏度結(jié)果

1～6. 稀釋倍數(shù)分別為102、103、104、105、106、107;7. 陽性對(duì)照;8. 陰性對(duì)照。A. HNB-LAMP反應(yīng)體系;B. 市售鈣黃綠素-LAMP試劑盒。

各受試菌株DNA在優(yōu)化的HNB-LAMP反應(yīng)體系中擴(kuò)增以驗(yàn)證方法特異性。僅單核細(xì)胞李斯特菌ATCC19115、單核細(xì)胞李斯特菌分離株B60和B62反應(yīng)管為陽性，呈天藍(lán)色，其余受試菌株反應(yīng)管均呈紫羅蘭色，表明該方法具有特異性。通過平板計(jì)數(shù)確定各梯度稀釋菌液的菌體濃度為2.4×102～2.4×107 CFU/mL。由圖4可知，各梯度稀釋菌液反應(yīng)管均呈天藍(lán)色，表明可視化HNB-LAMP法的純菌液檢測靈敏度達(dá)到102 CFU/mL，與市售鈣黃綠素-LAMP試劑盒的反應(yīng)結(jié)果一致。

2.4 人工污染肉制品中可視化HNB-LAMP法的檢出限分析結(jié)果

1～7. 菌體濃度分別為2.3×101、2.3×102、2.3×103、2.3×104、2.3×105、2.3×106、2.3×107 CFU/mL;8. 陽性對(duì)照;9. 陰性對(duì)照;10. 樣品勻漿。

取1 mL菌體濃度為2.3×102～2.3×108 CFU/mL的單核細(xì)胞李斯特菌菌液加入9 mL火腿樣品勻漿中，通過平板計(jì)數(shù)確定實(shí)際菌落數(shù)為2.3×101～2.3×107 CFU/mL。由圖5可知，菌體濃度為2.3×104～2.3×107 CFU/mL時(shí)，反應(yīng)管呈藍(lán)色，表明所建立的反應(yīng)體系對(duì)人工污染肉制品中單核細(xì)胞李斯特菌的檢出限為104 CFU/mL。

2.5 人工污染單核細(xì)胞李斯特菌樣品和實(shí)際冷凍畜禽肉樣品檢測結(jié)果

傳統(tǒng)微生物方法、HNB-LAMP法和PMA-HNB-LAMP法檢測人工污染活菌樣品的結(jié)果均為陽性;PMA-HNB-LAMP法和傳統(tǒng)微生物方法檢測人工污染死菌樣品的結(jié)果均為陰性，LAMP法檢測結(jié)果為陽性，表明PMA-HNB-LAMP法能抑制單核細(xì)胞李斯特菌死菌的擴(kuò)增。

對(duì)于隨機(jī)選取的20 份冷凍畜禽肉樣品，HNB-LAMP法檢出陽性樣品4 個(gè)（樣品編號(hào)5、9、14、15），陽性率20%;PMA-HNB-LAMP法檢出陽性樣品2 個(gè)（樣品編號(hào)5、14），陽性率10%;傳統(tǒng)微生物方法檢出陽性樣品1 個(gè)（樣品編號(hào)14），陽性率5%。PMA-HNB-LAMP法與傳統(tǒng)微生物方法的檢測結(jié)果相比，樣品5檢出假陽性，這可能是由于PMA處理對(duì)該樣品中的死菌不具有抑制效果，也可能是存在非單核細(xì)胞李斯特菌的假陽性菌株。PMA-HNB-LAMP法與HNB-LAMP法的檢測結(jié)果相比，少檢出2 個(gè)陽性樣品，由于這2 個(gè)樣品的傳統(tǒng)微生物方法檢測結(jié)果也為陰性，說明該樣品中單核細(xì)胞李斯特菌的死菌數(shù)低于105 CFU/mL，其擴(kuò)增經(jīng)過PMA處理后被抑制，也可能是HNB-LAMP法處理后出現(xiàn)了假陽性擴(kuò)增現(xiàn)象。

3 結(jié) 論

GB 29921—2013《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中致病菌限量》中規(guī)定：預(yù)包裝熟肉制品和即食生肉制品中每批次5 份樣品中均不得檢出單核細(xì)胞李斯特菌[31]。畜禽肉作為肉制品原料，是肉制品中單核細(xì)胞李斯特菌的主要污染來源之一。本研究將PMA、HNB和LAMP技術(shù)結(jié)合，建立用于檢測單核細(xì)胞李斯特菌的PMA-HNB-LAMP法，該方法特異性強(qiáng)，純菌液檢測靈敏度可達(dá)2.4×102 CFU/mL，檢測效果與市售試劑盒相當(dāng)。對(duì)人工污染畜禽肉樣品的檢測結(jié)果與傳統(tǒng)微生物方法一致;對(duì)實(shí)際畜禽肉樣品檢測時(shí)，該方法在一定程度上解決了由死菌擴(kuò)增引起的假陽性問題，并且對(duì)設(shè)備要求簡單，因此可用于肉制品企業(yè)生產(chǎn)中的品質(zhì)控制。但是檢測結(jié)果中仍出現(xiàn)了假陽性結(jié)果，因此仍需作進(jìn)一步研究。

此方法解決了LAMP技術(shù)的2 個(gè)方法學(xué)問題，即添加指示劑實(shí)現(xiàn)可視化檢測結(jié)果，以及區(qū)別檢測食品中單核細(xì)胞李斯特菌的死菌和活菌從而降低假陽性率。該方法克服了檢測設(shè)備簡單、檢測人員不足的困難，可推廣應(yīng)用于多種致病菌的檢測，為食品安全提供新的檢測思路和技術(shù)平臺(tái)支持。

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