中草藥對(duì)異育銀鯽感染嗜水氣單胞菌防治效果的研究

陳 凱 謝 駿，2 吳家玉,2 潘良坤 潘曉川

(1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部淡水漁業(yè)和種質(zhì)資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214081；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)無(wú)錫漁業(yè)學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214128；3.加拿大經(jīng)典中醫(yī)研究院，不列顛哥倫比亞 溫哥華 V8W 1Z3)

嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)是一種常見的水生動(dòng)物條件致病菌，由于近年來(lái)養(yǎng)殖密度、養(yǎng)殖環(huán)境以及藥物的不合理使用，使得以嗜水氣單胞菌為代表的水生動(dòng)物細(xì)菌性病害頻發(fā)且不易防治，由此對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

目前，中草藥及其提取物在水產(chǎn)病原菌體外抑菌研究較多，何愛華等(2011)、張海賓等(2006)、肖輝等(2009)在其研究中均發(fā)現(xiàn)黃連等中草藥對(duì)嗜水氣單胞菌具有明顯的抑菌作用。然而，一方面由于中草藥及其提取物成分組成復(fù)雜，其作用同時(shí)涉及對(duì)病原菌的抑殺和對(duì)宿主的免疫機(jī)能調(diào)節(jié)，另一方面從宿主的角度進(jìn)行藥物保護(hù)效果的評(píng)價(jià)更為簡(jiǎn)單直接，因此學(xué)者們更多的是從對(duì)宿主的保護(hù)率以及免疫功能等方面開展相關(guān)評(píng)估研究。目前對(duì)于中草藥有效成分如多糖、苷類和生物堿等，能提高機(jī)體免疫力，增強(qiáng)其對(duì)病原生物的防御能力的觀點(diǎn)已被廣泛認(rèn)同(敖禮林，2017)。但針對(duì)學(xué)者提出的“中草藥及其提取物還具有阻止、限制以及修復(fù)病原菌引起的組織損傷的能力，進(jìn)而使疾病進(jìn)程最小化，從而實(shí)現(xiàn)抵抗感染的致病作用”(趙小然，2017)，這一點(diǎn)在應(yīng)用中草藥開展水產(chǎn)病害防治研究方面的關(guān)注尚顯不足。而大黃、黃連作為水產(chǎn)細(xì)菌性病害防治的常用中草藥，為評(píng)價(jià)大黃、黃連相關(guān)組方是否具備這種以特異性組織損傷調(diào)控為靶向的作用效果，我們以異育銀鯽人工感染嗜水氣單胞菌為模型，開展了相關(guān)研究。

一、材料與方法

實(shí)驗(yàn)所用異育銀鯽均由中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院淡水漁業(yè)研究中心南泉養(yǎng)殖基地提供，魚體健康無(wú)傷，活力強(qiáng)，規(guī)格(53.6±4.5)克/尾。異育銀鯽被隨機(jī)分入相同型號(hào)的養(yǎng)殖桶中，持續(xù)增氧，光周期同自然光，水溫維持在(28±1)℃，每天投喂3次，投喂量為體重的2.5%。暫養(yǎng)適應(yīng)1周后開始實(shí)驗(yàn)。

實(shí)驗(yàn)所使用的嗜水氣單胞菌株為本實(shí)驗(yàn)室自行分離鑒定。菌株保存在-80℃甘油管中，使用前在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線，28℃過(guò)夜培養(yǎng)，挑取單克隆接種營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果調(diào)整細(xì)菌濃度為2.2×106CFU/毫升，按100微升/尾的劑量進(jìn)行腹腔注射。隨機(jī)將魚分為對(duì)照組、感染組、預(yù)防組、低劑量治療組和高劑量治療組，每組包含3個(gè)平行處理(即為3個(gè)養(yǎng)殖桶)，每個(gè)平行15尾魚。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)開始后不做攻毒處理，不使用藥物處理；感染組實(shí)驗(yàn)開始后進(jìn)行攻毒處理，但不使用藥物處理；預(yù)防組實(shí)驗(yàn)開始時(shí)先將藥物應(yīng)用到實(shí)驗(yàn)魚所在養(yǎng)殖桶，使藥物終濃度為40微升/升，藥物處理兩小時(shí)后進(jìn)行攻毒處理；低劑量治療組在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行攻毒處理，攻毒處理完成兩小時(shí)后應(yīng)用藥物處理，使藥物終濃度為4微升/升；高劑量治療組在實(shí)驗(yàn)開始時(shí)進(jìn)行攻毒處理，攻毒處理完成兩小時(shí)后應(yīng)用藥物處理，使藥物終濃度為40微升/升。

攻毒后24小時(shí)通過(guò)尾椎靜脈采集血液(每個(gè)平行10尾魚)，5000轉(zhuǎn)/分、5分鐘、4℃收集血漿，-20℃保存?zhèn)溆?。同時(shí)記錄攻毒后72小時(shí)內(nèi)的死亡數(shù)量(取樣魚不計(jì)入死亡數(shù)據(jù))及臨床癥狀。使用全自動(dòng)生化分析儀(邁瑞B(yǎng)S-400)檢測(cè)異育銀鯽血漿乳酸脫氫酶(LDH)、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)水平，所用血液生化試劑購(gòu)自上海執(zhí)誠(chéng)生物科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件包中的單因素方差分析，檢驗(yàn)各組間的差異，不同的字母表示各組之間比較差異顯著(P＜0.05)。

二、結(jié)果

1.臨床癥狀及死亡率

對(duì)照組魚類無(wú)明顯異常，體表未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，而實(shí)驗(yàn)組(感染組、預(yù)防組和治療組)的發(fā)病魚都出現(xiàn)肛門紅腫、體表有出血和腫脹現(xiàn)象，解剖可見腹腔內(nèi)偶有腹水、腸道內(nèi)無(wú)食物，內(nèi)臟有不同程度充血現(xiàn)象(圖1)。

圖1 感染異育銀鯽的臨床癥狀

對(duì)照組72小時(shí)存活率為100%，感染組72小時(shí)存活率為73.3%，預(yù)防組72小時(shí)存活率為77.8%，低劑量治療組A 72小時(shí)存活率為86.7%，高劑量治療組B 72小時(shí)存活率為80.0%(圖2，表1)。預(yù)防組和治療組的存活率均高于感染組，其中低劑量組的存活率最高。藥物保護(hù)效率分析結(jié)果顯示，低劑量組保護(hù)效果最佳，保護(hù)效率為50%。

圖2 不同處理方案下異育銀鯽的存活情況

表1 不同處理方案下異育銀鯽的死亡情況(n=15)

2.ALT、AST、LDH檢測(cè)結(jié)果及組織細(xì)胞損傷評(píng)價(jià)。

ALT檢測(cè)結(jié)果(圖3)顯示，感染組血漿ALT活性顯著高于對(duì)照組(P＜0.05)，而不同藥物處理方案干預(yù)后，其ALT活性與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。由此表明，嗜水氣單胞菌對(duì)異育銀鯽體內(nèi)組織器官造成了損傷，而上述藥物處理方案能明顯改善這一損傷的狀態(tài)，而不同處理方案在ALT水平上未表現(xiàn)出明顯的差異效果(P＞0.05)。

圖3 不同處理方案下對(duì)谷丙轉(zhuǎn)氨酶的影響

血漿AST活性(圖4)在各組之間的變化并不顯著(P＞0.05)，一方面可能細(xì)菌感染并未引起組織器官的細(xì)胞出現(xiàn)損傷相關(guān)，另一方面也顯示出該藥物的不同應(yīng)用方案可能對(duì)細(xì)胞損傷無(wú)明顯的保護(hù)作用。

圖4 不同處理方案下對(duì)谷草轉(zhuǎn)氨酶的影響

LDH檢測(cè)結(jié)果(圖5)表明，感染組血漿LDH活性與對(duì)照組相比出現(xiàn)了顯著升高(P＜0.05)，由此可見嗜水氣單胞菌感染造成了機(jī)體組織細(xì)胞的損傷，而這種損傷在預(yù)防和治療處理時(shí)均能得到有效的改善，其中低劑量治療處理和對(duì)相關(guān)指標(biāo)改善稍差，但與其他兩種處理方案結(jié)果無(wú)顯著差異(P＞0.05)。

圖5 不同處理方案下對(duì)乳酸脫氫酶的影響

三、討論

近年來(lái)，由于細(xì)菌耐藥問(wèn)題，使用抗生素防治水生動(dòng)物細(xì)菌性病害的傳統(tǒng)手段處境艱難，中草藥在國(guó)內(nèi)應(yīng)用于疾病防治歷史悠久，但由于中草藥長(zhǎng)期以來(lái)依賴于傳統(tǒng)中醫(yī)理論發(fā)揮其防治疾病的作用，并不能很好地被西醫(yī)理論體系所闡明，而其作為新型綠色漁藥研究的方向，應(yīng)用現(xiàn)代西醫(yī)理論闡明其防治疾病的機(jī)理對(duì)于其推廣應(yīng)用以及深入開發(fā)中草藥資源具有重要意義。目前關(guān)于中草藥治療疾病的研究主要涉及3個(gè)方面，其一是中草藥直接與病原菌作用，主要表現(xiàn)為抑菌、抑制毒力等方面的作用；其二是中草藥對(duì)宿主免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而間接作用于病原菌；其三是中草藥能對(duì)疾病進(jìn)程進(jìn)行干預(yù)，通過(guò)限制、修復(fù)疾病進(jìn)程中的組織細(xì)胞損傷，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的治療。

ALT、AST以及LDH均存在于細(xì)胞內(nèi)，但是在不同細(xì)胞中的含量不同。細(xì)胞損傷時(shí)釋放到血液中，進(jìn)而造成血液中相關(guān)指標(biāo)升高。目前人類醫(yī)學(xué)檢測(cè)中常常將血清ALT和AST水平用來(lái)評(píng)價(jià)肝臟的健康狀態(tài)，而血清LDH水平則常常用來(lái)診斷心肌性疾病，但是魚類相關(guān)研究中尚未明確指出ALT、AST和LDH和具體組織器官之間健康狀態(tài)的關(guān)聯(lián)性。不過(guò)，血清中ALT、AST和LDH與機(jī)體細(xì)胞損傷之間的關(guān)聯(lián)是毋庸置疑的，本研究以此作為前提，開展了對(duì)大黃、黃連相關(guān)組方對(duì)宿主組織損傷調(diào)控方面的研究，結(jié)果表明大黃、黃連相關(guān)組方確實(shí)存在對(duì)宿主組織損傷的改善作用，但是從不同方案處理后的死亡情況來(lái)看，預(yù)防處理的效果不理想，可見這種作用對(duì)于藥物應(yīng)用的時(shí)機(jī)把控十分重要，而關(guān)于具體應(yīng)用時(shí)機(jī)的定性，仍然需要大量的基礎(chǔ)研究。