[18F]-苯丙氟硼酸的制備工藝改進(jìn)及初步臨床應(yīng)用

周 明，李玉來，楊能安，李 建，陳小娟，胡 碩

(1.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 PET中心，湖南 長沙 410008；2.湖南省腫瘤醫(yī)院 藥學(xué)部，湖南 長沙 410013)

氨基酸是腫瘤增殖過程的必需營養(yǎng)物質(zhì)，利用放射性核素標(biāo)記氨基酸類似物作為顯像劑，對腫瘤進(jìn)行特異性顯像是近些年的研究熱點[1-4]。由于氨基酸結(jié)構(gòu)的特殊性，用11C或18F直接標(biāo)記產(chǎn)率低、穩(wěn)定性差[5]，而Al18F、68Ga、99mTc等都會對原有分子結(jié)構(gòu)有較大改變，容易導(dǎo)致標(biāo)記分子的靶向性降低、毒性變大[6]。氟硼酸結(jié)構(gòu)是一種與α-氨基酸結(jié)構(gòu)極其類似的結(jié)構(gòu)，研究表明，用氟硼酸結(jié)構(gòu)取代α-氨基酸結(jié)構(gòu)后化合物的藥代行為與原來氨基酸非常相似，因此可以用氟硼酸類化合物代替氨基酸類化合物進(jìn)行放射性標(biāo)記用于腫瘤的顯像研究[7-9]。

目前18F標(biāo)記氟硼酸類顯像劑主要采用氨基聚醚碳酸鉀溶液進(jìn)行淋洗，通過固相萃取純化，產(chǎn)率較低，終末產(chǎn)品需要檢查氨基聚醚和乙腈等有害物質(zhì)的殘留[9]。本研究擬對現(xiàn)有的標(biāo)記工藝進(jìn)行部分優(yōu)化，以獲得更加安全、高效的放射性18F標(biāo)記氟硼酸類顯像劑，并研究其在U87 MG細(xì)胞中的攝取情況，及在健康受試者體內(nèi)分布情況，為下一步的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 設(shè)備與材料

1.1 設(shè)備

PET/CT:美國GE Discover Elite；回旋加速器：美國GE Qilin；氟多功能藥物合成模塊：派特(北京)科技；Radio-TLC儀：美國 Bioscan公司；CRC-25R 型活度計：美國 Capintec公司；Radio-HPLC儀、分析型C18柱(5 μm, 4.6 mm×250 mm)：美國Agilent 公司；γ放射免疫分析儀：北京核海高技術(shù)有限公司。

1.2 材料

標(biāo)記前體苯丙氟硼酸由陳小元教授和劉志博教授惠贈；氨基聚醚(kryptofix2.2.2, K2.2.2)/K2CO3溶液：派特(北京)科技；Sep-Park Light Al2O3柱、Sep-Park Light C18柱：美國Waters公司；Millex.GS無菌過濾器(0.22 μm)：美國Millipore公司；色譜純乙腈：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；18O-H2O：江蘇華益；U87 MG細(xì)胞：中南大學(xué)細(xì)胞實驗中心。

2 實驗方法

2.1 對照組苯丙氟硼酸常規(guī)標(biāo)記方法

1)采用GE公司Qilin醫(yī)用質(zhì)子回旋加速器進(jìn)行18O(p，n)18F反應(yīng)生成18F-，加速器束流為50 μA，轟擊時間為20 min；2)將步驟18F-經(jīng)管道傳輸至Sep-Park Light QMA上并被QMA捕獲；3)反應(yīng)管中加入0.2 mL濃度為500 mmol/L的苯丙氟硼酸乙醇溶液和0.2 mL pH為2.5的噠嗪-鹽酸緩沖液；4)用K2.2.2/K2CO3的混合溶液0.5 mL18F-淋洗至安瓿瓶中，并取100 μL加入到反應(yīng)瓶中；5)80 ℃條件下苯丙氟硼酸溶液與18F-進(jìn)行核素交換反應(yīng)(如圖1);6)20 min后反應(yīng)體系加入去離子水5 mL進(jìn)行淬滅反應(yīng)；7)淬滅反應(yīng)后的體系直接過Sep-Park Light C18柱純化，并用10 mL水清洗C18柱；8)用50%的乙醇溶液5 mL淋洗C18柱即得[18F]-苯丙氟硼酸溶液([18F]-Phe-BF3)。

圖1 [18F]-苯丙氟硼酸合成路線圖

2.2 實驗組苯丙氟硼酸標(biāo)記方法

1)18F-生產(chǎn)與捕獲方式與實驗組相同，反應(yīng)管中加入0.2 mL濃度為500 mmol/L的苯丙氟硼酸乙醇溶液；2)用pH=2的鹽酸氯化鈉溶液0.5 mL將18F-淋洗至安瓿瓶中，并取100 μL加入到反應(yīng)瓶中；3)80 ℃條件下苯丙氟硼酸溶液與18F-進(jìn)行同位素交換反應(yīng)；4)20 min后反應(yīng)體系加入5 mL去離子水進(jìn)行淬滅反應(yīng)；5)淬滅反應(yīng)后的體系直接過Sep-Park Light Al2O3柱純化得產(chǎn)品溶液，比活度為(6.11±0.25)MBq/μmol。

2.3 [18F]-苯丙氟硼酸質(zhì)量控制

對產(chǎn)品溶液的理化性質(zhì)、放化純度、細(xì)菌、內(nèi)毒性等質(zhì)控指標(biāo)進(jìn)行測定(參考2015版藥典)。對比放射性產(chǎn)物[18F]-苯丙氟硼酸與反應(yīng)原料[19F]-苯丙氟硼酸(標(biāo)準(zhǔn)品)HPLC保留時間，確定放射性產(chǎn)物純度的流動相為0～2 min，5%乙腈；2～10 min，20%乙腈；10～15 min，100%乙腈。

2.4 細(xì)胞攝取實驗

為了確定顯像劑[18F]-苯丙氟硼酸是否與腫瘤細(xì)胞有靶向性，選用U87 MG人膠質(zhì)瘤細(xì)胞，分為三組，其中實驗組為[18F]Phe-BF3，阻斷組為[18F]-Phe-BF3+Phe-BF3，游離18F-為對照組。實驗組細(xì)胞經(jīng)PBS清洗三次，加入顯像劑[18F]-Phe-BF32.96 MBq，孵育1 h，再用PBS清洗三次后加0.5 mL 1 mol/L NaOH，最后收集細(xì)胞液測γ計數(shù)；阻斷組細(xì)胞經(jīng)PBS清洗三次，加入Phe-BF3(500 mg/L)，孵育0.5 h后，加顯像劑2.96 MBq，再孵育1 h，然后PBS清洗三次后，加0.5 mL 1 mol/L NaOH，收集細(xì)胞液測γ計數(shù)；對照組加游離18F-2.96 MBq，孵育1 h，PBS清洗三次后加0.5 mL 1 mol/L NaOH，最后收集細(xì)胞液測γ計數(shù)。各組保持最終體積一致。

2.5 PET顯像

2.5.1受試人群 共招募志愿者3人，其中男性1人，女性2人，年齡在56～60歲，中位年齡57歲，3人體檢無器質(zhì)性疾病。該項目已通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(201601007)，檢查前告知受檢者并簽署知情同意書。

2.5.2顯像方法 受檢者仰臥于PET/CT檢查床，靜脈注射[18F]-苯丙氟硼酸4.44 MBq/kg后，分別于5、15、30、45、60、75、90 min，分別進(jìn)行PET/CT靜態(tài)掃描，先進(jìn)行CT掃描，掃描范圍及順序為腦部-盆腔，然后立即進(jìn)行PET采集，采集范圍同CT，采集順序為盆腔-腦部，共8個床位，每個床位15.7 cm，每個床位間重疊3.7 cm，PET采集方法采用3D-TOF序列，CT掃描管電壓為120 kV、自動mAs、螺距為0.984∶1、矩陣512×512，PET矩陣256×256，CT及PET層厚均為3.75 mm。

2.5.3圖像重建和數(shù)據(jù)處理 PET圖像重建均用有序子集最大期望值迭代(OSEM)法，得到三維圖像及橫斷、冠狀、矢狀斷層圖像。將PET和CT圖像傳到GE AW 4.6后處理工作站，進(jìn)行幀對幀圖像對位融合，在健康志愿者腦、肺、心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎實質(zhì)、膀胱、肌肉及骨髓等處分別勾畫感興趣區(qū)(ROI)的放射性攝取，取ROI區(qū)內(nèi)放射性計數(shù)平均值即平均標(biāo)準(zhǔn)攝取值(SUV)，所有ROI測量3次取平均值，計算SUV，根據(jù)公式SUV=病灶的放射性濃度(kBq/mL)/注射劑量(MBq)/體重(kg)，由AW 4.6后處理工作站完成。

3 實驗結(jié)果

3.1 質(zhì)量控制

1)理化性質(zhì)：各三批產(chǎn)品均為無色透明溶液，pH 均為6到7之間。2)K2.2.2殘留：對照組產(chǎn)品溶液中K2.2.2均大于50 mg/L。3)細(xì)菌內(nèi)毒素：參考2015版藥典進(jìn)行細(xì)菌、內(nèi)毒素檢測，結(jié)果表明，細(xì)菌和內(nèi)毒素均未檢出。4)放化純度：實驗組產(chǎn)品溶液利用HPLC檢測純度，實驗結(jié)果表明產(chǎn)品化合物放化純度大于99%，無明顯雜質(zhì)峰(如圖2)。

3.2 放化產(chǎn)率對比

實驗組和對照組各實驗三次，結(jié)果對照組產(chǎn)率為(4.16±0.26)%，實驗組產(chǎn)率為(10.26±0.42)%(P=0.000 03)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，如表1所示。

圖2 [18F]-苯丙氟硼酸產(chǎn)品溶液放化純度HPLC圖譜

表1 [18F]苯丙氟硼酸產(chǎn)率比較

注：對照組和實驗組差異顯著，P<0.01

3.3 細(xì)胞攝取實驗

孵育1 h后，U87 MG人膠質(zhì)瘤細(xì)胞系[18F]-Phe-BF3計數(shù)率為：實驗組(9.6±1.5)/min-1，阻斷組(7.5±1.1)/min-1，游離18F對照組(4.4±0.9)/min-1。計算攝取值，實驗組與阻斷組(P=0.007)、實驗組與游離18F對照組(P=0.008)的差異均具有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

3.4 PET顯像

3名健康志愿者均成功完成顯像。注射顯像劑后隨訪至24 h(10個半衰期)，志愿者均未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)。受試者注射顯像劑5、10、15、30、60、90 min后顯像，可見5 min時顯像劑在心、肝、脾、胰腺、骨髓等臟器濃聚，隨著時間延長，在心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎實質(zhì)及骨髓中攝取隨時間逐漸減低，至30 min后接近本底(圖4)。而[18F]苯丙氟硼酸在不同時相人體腦組織及肺組織中放射性攝取均很低(圖5)，表明該顯像劑在正常腦組織中本底低，有利于顯示高攝取的病灶，同時該顯像劑主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，在腎盂、輸尿管及膀胱中呈高攝取。

圖3 [18F]-苯丙氟硼酸細(xì)胞攝取實驗

圖4 [18F]-苯丙氟硼酸在人體動態(tài)PET顯像圖

a——PET image;b——CT image;c——PET/CT image; d——PET/CT whole-body image

4 討論

本研究首次嘗試在[19F]氟硼酸標(biāo)記過程中，用鹽酸氯化鈉溶液洗脫18F-，既避免了為保證反應(yīng)濃度對反應(yīng)18F-的濃縮，也避免了將18F-傳輸至濃縮管再轉(zhuǎn)至反應(yīng)管過程中的損失；同時，采用鹽酸氯化鈉溶液作為淋洗18F-溶液，不僅可以很好的實現(xiàn)對18F-的淋洗，還保證反應(yīng)過程中的酸性要求。此外，鹽酸氯化鈉溶液作為18F-淋洗液，相比氨基聚醚碳酸鉀溶液明顯具有更高的安全性，反應(yīng)體系也無需額外純化步驟，經(jīng)簡單的直接稀釋過柱即可直接用于人體，安全系數(shù)高，而且產(chǎn)品無需檢查氨基聚醚和乙腈等有機物的殘留。

細(xì)胞攝取實驗結(jié)果中，加[19F]-苯丙氟硼酸作為抑制劑的實驗組與單純的[18F]-苯丙氟硼酸實驗組相比細(xì)胞攝取計數(shù)差別不是很大，原因有可能是[18F]-苯丙氟硼酸產(chǎn)品溶液中的[19F]-苯丙氟硼酸含量高，因為核素交換反應(yīng)一般產(chǎn)率都不高，而且反應(yīng)前體與產(chǎn)品因為結(jié)構(gòu)一樣也很難純化分離，產(chǎn)品[18F]-苯丙氟硼酸中含有的部分[19F]-苯丙氟硼酸已經(jīng)對細(xì)胞攝取產(chǎn)生了較強的抑制作用，再額外加入[19F]-苯丙氟硼酸作為抑制劑效果可能不太明顯。

通過健康志愿者18F-苯丙氟硼酸PET/CT連續(xù)顯像發(fā)現(xiàn)，該顯像劑在正常腦組織中所有采集時像中放射性攝取均很低，表明該顯像在正常腦組織中本底很低，而通過細(xì)胞攝取實驗發(fā)現(xiàn)U87 MG人膠質(zhì)瘤細(xì)胞能特異性攝取[18F]-苯丙氟硼酸，因此可以預(yù)見膠質(zhì)瘤將呈高的放射性攝取，而這將為臨床膠質(zhì)瘤診斷提供有力的影像學(xué)支持。同時，[18F]-苯丙氟硼酸在肺組織中分布較少，而在心臟、肝臟、脾臟、胰腺、腎實質(zhì)及骨髓中攝取隨時間逐步減低，至30 min后基本接近本底，說明注射顯像劑后30 min即可以開始顯像。[18F]-苯丙氟硼酸主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，因此檢查結(jié)束后大量飲水可以讓顯像劑盡快排出體外，減少人體所受輻射。人體動態(tài)顯像提示，該顯像劑能夠較快的進(jìn)行代謝分布，并且全身實質(zhì)臟器攝取較低，主要通過泌尿系統(tǒng)排泄，提示[18F]-苯丙氟硼酸未來用于臨床顯像時背景干擾小，很可能作為一種有效的新型顯像劑用于臨床研究。