特發(fā)性膜性腎病腎組織中足細(xì)胞數(shù)目減少與α3β1整合素關(guān)系

雷靜，蘇曉曉，張蓓茹，何平，周華

無明顯誘因的膜性腎病稱為特發(fā)性膜性腎病(idiopathic membranous nephropathy,IMN)，其是腎病綜合征和原發(fā)性腎小球疾病的常見原因。近年來IMN在原發(fā)性腎小球疾病中的構(gòu)成比明顯增多[1]。IMN是一種非炎性自身免疫性腎病，其病理特征為存在上皮下免疫復(fù)合物，通過光學(xué)顯微鏡觀察到腎小球基底膜彌漫性增厚，以及通過免疫熒光發(fā)現(xiàn)沿著腎小球毛細(xì)血管環(huán)周邊的IgG和補(bǔ)體顆粒沉積。IMN的病因?yàn)樯掀は略幻庖邚?fù)合物沉積，C5b-9形成，插入足細(xì)胞中。足細(xì)胞通過合成腎小球基底膜(GBM)的組成部分、狹縫隔膜，參與保持內(nèi)皮細(xì)胞的穩(wěn)定性來維持腎小球?yàn)V過率及GBM的完整性[2]。而足細(xì)胞凋亡是IMN進(jìn)展中的關(guān)鍵步驟。整合素是腎小球?yàn)V過膜與足細(xì)胞的主要黏附分子，在調(diào)控細(xì)胞生存中起到重要作用，狹縫隔膜是限制蛋白質(zhì)濾過最重要的屏障，而ɑ3β1整合素是連接足細(xì)胞和狹縫隔膜的重要組成成分，也是維持足細(xì)胞抵抗濾過壓力的重要組成部分。目前對于整合素介導(dǎo)的足細(xì)胞生存在許多疾病中均有研究[3-4]，但對于整合素與特發(fā)性膜性腎病中足細(xì)胞的關(guān)系鮮見報道。本研究探討IMN中足細(xì)胞的減少與整合素ɑ3β1的關(guān)系，報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料 (1)腎組織: 采集2016年2月—2017年3月中國醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院腎內(nèi)科經(jīng)臨床和腎活檢確診的IMN住院患者30例的活檢腎組織石蠟切片(病例組)，排除糖尿病、腫瘤、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病引起的膜性腎病。其中男19例，女11例； 年齡28～66歲，中位數(shù)48.7歲。 同期于本院泌尿外科行腎臟腫瘤手術(shù)患者30例，采取遠(yuǎn)離腫瘤的正常區(qū)域腎組織(對照組)，制作石蠟切片，其中男23例，女7例；年齡31～72歲，中位數(shù)54.5歲。(2)試劑：腎母細(xì)胞瘤抑制基因1(Wilms' tumor suppressor gene，WT1)兔抗人單克隆抗體(北京中杉金橋公司)；整合素ɑ3、整合素β1兔抗多克隆抗體(abcam公司)；免疫組化試劑盒，DAB顯色試劑(北京中杉金橋公司)。(3)儀器： Nis-Elements F 3.0(日本)圖像采集軟件、圖像分析軟件； Nikon E 800(日本)顯微鏡。

1.2 觀測指標(biāo)與方法

1.2.1 腎小球足細(xì)胞WT1表達(dá)檢測： WT1抗原在腎小球足細(xì)胞核表達(dá)，在其余腎組織中不表達(dá)，因此可用來評估腎小球足細(xì)胞數(shù)量。采用免疫組化方法對足細(xì)胞進(jìn)行特異性染色。對2種腎組織石蠟切片脫蠟至水，于檸檬酸—檸檬酸鈉緩沖液中進(jìn)行微波抗原修復(fù)7.5 min，室溫自然冷卻，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗片，滴加3% H2O2室溫孵育40 min，PBS洗片，正常羊血清室溫封閉40 min，PBS洗片，滴加抗WT1單克隆抗體，4 ℃孵育過夜，次日室溫復(fù)溫20 min，PBS洗片，滴加二抗，室溫孵育25 min，PBS洗片，滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵白素工作液20 min，PBS洗片，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，流水返藍(lán)，脫水透明后用中性樹脂封片、觀察，細(xì)胞核染色為棕褐色者為足細(xì)胞。以PBS取代一抗作為陰性對照。

1.2.2 腎小球足細(xì)胞相對密度計(jì)算：按如下公式計(jì)算，Dpodo =Npodo/GRoi ×△S ×106(Cells/μm2)[13],Npodo為每個腎小球足細(xì)胞絕對數(shù)目，GRoi 為Nis-Elements Br-3.0分析軟件所選感興趣區(qū)域的面積，即腎小球的相對面積。于400倍顯微鏡下測量圖像的長和寬，計(jì)算出圖像框的實(shí)際面積A(μm2)，Nis-Elements Br-3.0分析軟件的“免疫組化自動分析模塊”測量圖像框的統(tǒng)計(jì)框總面積R(μm2)。△S =A/R，經(jīng)計(jì)算400倍圖像△S =0.006 729 μm2。

1.2.3 腎小球足細(xì)胞ɑ3β1整合素表達(dá)檢測：采用免疫組化方法檢測。通過Nis-Elements Br-3.0軟件分析ɑ3β1整合素表達(dá)的平均光密度值并進(jìn)行免疫組化半定量分析。具體步驟除每張切片滴加α3多克隆抗體(濃度1∶1 500)或β1多克隆抗體(濃度1∶1 500)外，其他同WT1表達(dá)檢測。

2 結(jié) 果

2.1 2組足細(xì)胞絕對數(shù)目及相對密度比較 病例組患者單位腎小球足細(xì)胞絕對數(shù)目(Npodo)及相對密度(Nv)均低于對照組(P均<0.05)，見表1、圖1。

2.2 2組腎小球ɑ3β1整合素表達(dá)比較 病例組腎小球ɑ3β1整合素表達(dá)的平均光密度值(2 795.33±3 999.97)較對照組(7 031.94±8 702.80)降低(t/P=2.423/0.020)，見圖2。

表1 2 組腎組織足細(xì)胞數(shù)目及密度比較

圖1 WT1 標(biāo)記足細(xì)胞核的腎小球病理表現(xiàn)

圖2 腎小球ɑ3β1整合素表達(dá)變化

2.3 足細(xì)胞與ɑ3β1整合素及腎功能相關(guān)性分析 Pearson相關(guān)分析顯示，足細(xì)胞絕對數(shù)和相對密度分別與ɑ3β1整合素呈正相關(guān),即隨著整合素表達(dá)升高，足細(xì)胞絕對數(shù)目、相對密度均升高，與24 h尿蛋白呈負(fù)相關(guān)，即隨IMN患者足細(xì)胞絕對數(shù)和相對密度降低，24 h尿蛋白升高；足細(xì)胞絕對數(shù)和相對密度與肌酐、白蛋白未見顯著相關(guān)(P>0.05)，見表2。

表2 IMN患者足細(xì)胞數(shù)量與ɑ3β1整合素及腎功能相關(guān)性

3 討 論

膜性腎病是成人腎病綜合征腎活檢診斷中最常見的疾病類型，如果未經(jīng)治療，約1/3可自發(fā)緩解，特別是抗PLA2R水平不足或較低的患者，10年內(nèi)進(jìn)展終末期腎病(ESRD)的患者約占1/3，其余患者發(fā)展為非進(jìn)展性慢性腎病(CKD)，因此對診斷為膜性腎病的患者進(jìn)行積極干預(yù)治療非常重要。在IMN中[5]，沉積物處于上皮下位置，直接與足細(xì)胞的足突相鄰，免疫介導(dǎo)的疾病可損傷足細(xì)胞，而足細(xì)胞減少也是IMN進(jìn)展的關(guān)鍵。足細(xì)胞作為構(gòu)成濾過膜的重要組成成分，其數(shù)目減少可導(dǎo)致腎小球?yàn)V過膜損傷，反過來也加速了足細(xì)胞的丟失，導(dǎo)致IMN的進(jìn)展。

本實(shí)驗(yàn)通過用WT1標(biāo)記足細(xì)胞核來檢測病例組與對照組腎組織切片的足細(xì)胞絕對數(shù)目，計(jì)算其相對密度，結(jié)果顯示，病例組足細(xì)胞絕對數(shù)目、相對密度均較對照組降低。尚瑜等[6]分析了36例MN患者，發(fā)現(xiàn)腎組織中足細(xì)胞數(shù)目明顯減少，與此實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。且尚瑜等[7]通過測量IMN患者尿中足細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示，Ⅱ期和Ⅲ期膜性腎病患者尿足細(xì)胞數(shù)較Ⅰ期膜性腎病患者明顯減少,表明足細(xì)胞在發(fā)病初期從尿中丟失最為明顯。足細(xì)胞是一種特異性的終末分化細(xì)胞，是不可再生細(xì)胞。導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡的可能因素有：(1)細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)，如氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促使RAAS系統(tǒng)所致的足細(xì)胞損傷[8]，其中醛固酮可通過鈣皮質(zhì)激素受體(MR)來介導(dǎo)足細(xì)胞損傷[9]，同時醛固酮還增加C末端Src激酶(Csk)的表達(dá)，誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡[10]。(2)若患者合并高血糖，也可通過誘導(dǎo)活性氧產(chǎn)生而引起足細(xì)胞凋亡[11]。(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累的未折疊蛋白導(dǎo)致的細(xì)胞壓力稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而長期或持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能具有細(xì)胞毒性，導(dǎo)致足細(xì)胞凋亡[9]。(4)各種細(xì)胞因子也參與足細(xì)胞的凋亡， 轉(zhuǎn)化生長因子-β1在足細(xì)胞中可誘導(dǎo)特定的信號通路，參與足細(xì)胞的存活和凋亡平衡[12]。腫瘤壞死因子-α被認(rèn)為參與足細(xì)胞凋亡，但其機(jī)制尚不完全清楚[13]。

蛋白尿的產(chǎn)生與腎小球?yàn)V過屏障密切相關(guān)，濾過屏障主要由毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜及足細(xì)胞構(gòu)成，腎小球毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞屬于有孔內(nèi)皮細(xì)胞，其窗孔只有一層帶負(fù)電荷酸性糖蛋白組成的細(xì)胞衣覆蓋，可阻止白蛋白等大分子通過。足細(xì)胞的突起相互交織，在這些足突之間覆有一層裂孔隔膜。而且，足細(xì)胞足突中的細(xì)胞骨架與細(xì)胞內(nèi)的相關(guān)蛋白相互作用，維持濾過屏障的完整性。本實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了IMN患者足細(xì)胞與白蛋白、肌酐及24 h尿蛋白的關(guān)系，結(jié)果表明，足細(xì)胞絕對數(shù)目、相對密度與白蛋白無明顯相關(guān)性，這可能與IMN患者濾過屏障破壞使得白蛋白丟失過多有關(guān)，而測量的足細(xì)胞數(shù)是腎穿刺時腎組織僅存的足細(xì)胞。且足細(xì)胞絕對數(shù)目、相對密度與肌酐無明顯相關(guān)性，但隨著腎組織中足細(xì)胞絕對數(shù)目與相對密度的降低，尿蛋白逐漸增多。既往有研究表明[7]，IMN患者尿中足細(xì)胞數(shù)與24 h尿蛋白呈負(fù)相關(guān)。目前研究認(rèn)為，足細(xì)胞足突中的肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，繼而發(fā)生隔膜蛋白改變出現(xiàn)蛋白尿[14]，隨著蛋白尿的進(jìn)一步加重，又反過來繼續(xù)損害足細(xì)胞，造成濾過屏障進(jìn)一步破壞。因此，足細(xì)胞損傷或耗竭在蛋白尿的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。

整合素是異質(zhì)二聚體的穿膜蛋白，由ɑ和β亞基組成，它們是細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)黏附的受體。足細(xì)胞主要經(jīng)ɑ3β1整合素錨定在GBM上。在本研究中，病例組整合素的總表達(dá)量明顯低于對照組。ɑ3β1整合素對維持濾過屏障結(jié)構(gòu)完整性有重要作用。ɑ3β1介導(dǎo)足細(xì)胞黏附于GBM的Ⅳ型膠原、層黏連蛋白和纖維連接蛋白上，其表達(dá)改變會使足細(xì)胞與GBM的黏附性下降，導(dǎo)致足細(xì)胞脫落。敲除ɑ3基因，動物在出生時死亡，發(fā)現(xiàn)其腎小球中足細(xì)胞完全脫落，而敲除β1后，動物出生后出現(xiàn)大量蛋白尿，同時發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞丟失。而其中涉及機(jī)制可能為，ɑ3β1通過下調(diào) Bax/Bcl-2、蛋白激酶C通路阻止足細(xì)胞凋亡和脫落[15]。

因此，腎組織切片中足細(xì)胞絕對數(shù)目及相對密度可用于輔助評價IMN患者病情嚴(yán)重程度。同時，也應(yīng)該同時監(jiān)測尿液中足細(xì)胞數(shù)目的變化，進(jìn)一步證實(shí)足細(xì)胞在膜性腎病進(jìn)展中的作用。目前對于IMN患者腎組織中足細(xì)胞與整合素、PLA2抗體等研究及足細(xì)胞與患者的臨床、病理指標(biāo)等研究較少，還需大量的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)深入探究足細(xì)胞在膜性腎病中的作用。

利益沖突：所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明

雷靜：實(shí)施研究過程，數(shù)據(jù)收集，分析整理，設(shè)計(jì)論文框架，撰寫論文；蘇曉曉：進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研與整理；張蓓茹：協(xié)助修訂論文；何平：研究選題，設(shè)計(jì)研究方案、研究流程，修訂論文，論文終審；周華：提出研究方向