薏苡仁油致突變性實驗研究

黃樣增，張 昆，陳言枧，吳長輝，姚渭溪，陳冠敏，李 曄

(1.福建仙芝樓生物科技有限公司 藥用菌栽培與深加工國家地方聯合工程研究中心，福州 350002;2.福建省疾病預防控制中心，福州 350001)

薏苡仁油是從禾本科植物薏苡(Coixlacryma-jobiL. var.ma-yuan(Roman.)Stapf)的干燥成熟種仁[1]中提取的，薏苡仁含有2%～8%的薏苡仁油。張棟霞[2]、謝春英[3]等發(fā)現薏苡仁油中的主要成分有薏苡內酯(又稱薏苡素)、脂肪酸甘油酯、甾醇、角鯊烯及維生素E等，具有增強免疫力[4]和抗腫瘤[5]等作用，其應用前景十分廣闊。但是，目前對于薏苡仁油的遺傳毒性報道較少，缺乏相關研究數據。遺傳毒性研究是非臨床安全性評價的重要內容，包括致突變性、致癌性、致畸性。本試驗按照《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》，通過對鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)、小鼠骨髓細胞微核試驗和小鼠精子畸形試驗對薏苡仁油的致突變性進行評價，以期為薏苡仁油的開發(fā)利用以及安全食用提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗樣品

薏苡仁油軟膠囊，薏苡仁按照《中國藥典》檢測合格后，采用圖1生產工藝流程制備薏苡仁油(密度為0.87 g/L)，直接經壓丸后制得。藥理取薏苡仁油軟膠囊內容物，即薏苡仁油。

1.1.2 試驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境

選用上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供的清潔級健康ICR小鼠200只，體重25～30 g；清潔級SD大鼠80只，體重67～85 g，雌雄各半。許可證號為SCXK(滬)2012-0002。小鼠、大鼠飼養(yǎng)于福建省疾病預防控制中心SPF級動物實驗室，許可證號為SYXK(閩)2012-0008。

注：超臨界CO2萃取條件為萃取壓力25 MPa、萃取溫度60℃、分離壓力6.5 MPa、分離溫度45℃、CO2流量100 L/h、萃取時間4 h。

圖1 薏苡仁油生產工藝流程

1.1.3 菌株

鼠傷寒沙門氏組氨酸缺陷型菌株TA98、TA97、TA102和TA100，由福建省疾病預防控制中心贈送(購于復旦大學公共衛(wèi)生學院)，經鑒定符合要求后再進行試驗。

1.1.4 儀器與試劑

電子天平，BSC-1360ⅡA2生物安全柜，SHP-250生化培養(yǎng)箱，DK-S28電熱恒溫水溫箱，SS-325型自動高壓滅菌器，自動菌落計數儀，Olympus CH顯微鏡。

絲裂霉素C(MMC)，2，4，7-三硝基芴酮(2，4，7-TNFone)，2-氨基芴(2-AF)，1，8-二羥基蒽醌，三氮化鈉(NaN3)，二甲基亞砜(0.055 MPa，20 min滅菌)，環(huán)磷酰胺(40 mg/kg)，大豆油。

1.2 試驗方法

1.2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)

釆用多氯聯苯誘導的大鼠肝勻漿作為體外代謝活化系統。稱取樣品5.0 g加二甲基亞砜至100 mL作為高劑量受試物，量取高劑量受試物20 mL加二甲基亞砜至100 mL攪拌均勻作為次高劑量受試物，以下3個劑量如此類推配制，由高到低配成5 000、1 000、200、40、8 μg/皿5個劑量，經0.103 MPa、20 min滅菌，同時設自發(fā)回變組、陽性對照組和溶劑(二甲基亞砜)對照組，每個劑量設3個平皿。在頂層瓊脂中加入0.1 mL受試物溶液、0.1 mL測試菌株增菌液和0.5 mL S-9混合液(當需要代謝活化時)，混勻后倒入底層培養(yǎng)基平板上，于37℃培養(yǎng)48 h，計數每皿回變菌落數，試驗重復1次。如果樣品的回變菌落數是溶劑對照組回變菌落數2倍以上，并具有劑量反應關系則定為試驗結果陽性。

1.2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗

選取50只體重25～30 g健康小鼠，雌雄各半，各性別小鼠隨機按體重分成5組，每組5只。鑒于動物、人的種屬和個體之間的生物學差異，安全系數通常為100，因此試驗設3個劑量組為4.35、8.70、17.40 g/kg，相當于成人推薦量的130、261、522倍，另設陽性(環(huán)磷酰胺)對照組、溶劑(大豆油)對照組。分別稱取樣品2.5、5.0、10.0 mL各加大豆油至20 mL配成3個濃度，各組動物分別按體重0.02 mL/g間隔24 h灌胃給予不同濃度的受試物及對照物2次，末次灌胃6 h后脫頸椎處死動物，取胸骨骨髓用小牛血清稀釋涂片，經甲醇固定，Giemsa染色。在光學顯微鏡下觀察，每只動物計數1 000個嗜多染紅細胞(PCE)，微核發(fā)生率以含微核PCE率計，按χ2檢驗進行統計分析。同時計數200個PCE，求出 PCE(嗜多染紅細胞)/NCE(正染紅細胞)值。

1.2.3 小鼠精子畸形試驗

選用體重25～30 g雄性性成熟小鼠25只，隨機按體重分成5組，每組5只，試驗設3個劑量組為4.35、8.70、17.40 g/kg，相當于成人推薦量的130、261、522倍，另設溶劑對照組和陽性對照組。分別稱取樣品2.5、50、10.0 mL各加大豆油至20 mL配成3個濃度，各組動物分別按0.02 mL/g灌胃給予不同濃度的受試物及對照物，連續(xù)5 d。于首次灌胃后35 d，處死動物，取雙側附睪尾按標準程序制片、染色，顯微鏡下每只動物觀察1 000個完整精子，記錄各類畸形精子數，計算精子畸形率，按χ2檢驗進行統計分析。

2 結果與分析

2.1 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)(見表1、表2)

由表1、表2可見，陽性對照組菌株的回變菌落數均超過自發(fā)回變組和溶劑(二甲基亞砜)對照組2倍以上，而該樣品受試物各劑量組的回變菌落數均未超過溶劑對照組回變菌落數的2倍。說明Ames試驗結果為陰性。

2.2 小鼠骨髓細胞微核試驗(見表3)

由表3可見，該樣品各劑量組PCE(嗜多染紅細胞)/NCE(正染紅細胞)未少于溶劑對照組的20%，提示骨髓紅細胞系統的增殖并無明顯抑制，對嗜多染紅細胞微核的觀察無明顯影響。陽性(環(huán)磷酰胺)對照組微核發(fā)生率明顯高于溶劑對照組，差異有統計學意義(P<0.01)，而樣品各劑量組與溶劑對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，說明該樣品未表現出使小鼠骨髓PCE微核率上升的致突變效應。

表1 樣品Ames試驗結果(第一次)

表2 樣品Ames試驗結果(第二次)

表3 樣品小鼠骨髓細胞微核試驗結果

注：*表示與溶劑對照組相比P<0.01。下同。

3.3 小鼠精子畸形試驗(見表4)

由表4可見，陽性(環(huán)磷酰胺)對照組與溶劑(大豆油)對照組比較，差異有統計學意義(P<0.01)，而樣品各劑量組與溶劑對照組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，可見樣品對小鼠精子畸形率未產生明顯改變，提示該樣品對小鼠精子不產生畸變作用。

表4 樣品小鼠精子畸形試驗結果

3 結 論

采用反映基因突變的Ames試驗、反映染色體損害的小鼠骨髓細胞微核試驗和反映生殖細胞突變的小鼠精子畸形試驗研究薏苡仁油的致突變性。結果發(fā)現，薏苡仁油對小鼠骨髓細胞微核無明顯增多作用，對雄性小鼠生殖細胞無遺傳損傷作用，也不具有基因致突變作用。因此，在本試驗條件下，薏苡仁油未顯示有致突變性。試驗表明薏苡仁油對人體無致突變作用。