亞麻籽降膽固醇活性肽的酶解工藝優(yōu)化及分級制備

包小蘭，劉曉靜，鄭 睿，李雪馨，朝魯巴根

(1.內蒙古農業(yè)大學 食品科學與工程學院，呼和浩特 010018； 2.內蒙古國際蒙醫(yī)醫(yī)院，呼和浩特 010065)

高膽固醇血癥是造成冠心病等心血管疾病的主要危險因素[1]。近年來，隨著我國經濟的發(fā)展，居民飲食結構發(fā)生了很大的變化，飲食結構的不平衡以及運動的缺乏導致高膽固醇血癥的發(fā)病率逐年升高，且越來越趨于低齡化[2]。目前，市場上常見的降脂類藥物為他汀類、貝特類和煙酸類等，這些藥物雖然能夠有效降低人體總膽固醇含量，但存在一些副作用[3-4]。因此，尋找并開發(fā)更為安全、效果持久的具有降膽固醇活性的食物成分成為研究熱點[5]。

亞麻籽主產于美洲和亞洲，適宜生長在寒冷地區(qū)[6]。我國的內蒙古和新疆維吾爾自治區(qū)、甘肅、云南、寧夏和青海等高緯度地區(qū)都有亞麻籽的生產種植基地。亞麻籽除了富含油脂、蛋白質、膳食纖維等多種營養(yǎng)成分[7-8]，還含有多種生物活性物質，具有很高的營養(yǎng)價值。目前，我國的亞麻籽更多用于直接壓榨制備亞麻籽油，而對于榨油后的亞麻籽餅的深加工利用較少。榨油后的亞麻籽餅中還含有30%～40%的蛋白質，未得到有效利用，造成了巨大的資源浪費[9-11]。因此，對亞麻籽餅進行充分的開發(fā)利用有著深遠的影響。

本實驗室前期已對亞麻籽蛋白的提取方式進行了探討，并對其生物活性進行了研究，發(fā)現(xiàn)亞麻籽分離蛋白具有一定的降膽固醇活性，但其具體的作用成分還未得到充分驗證。因此，本文以亞麻籽分離蛋白為原料，研究了不同蛋白酶對其的水解程度，以降膽固醇活性為評價指標優(yōu)化酶解工藝，并對酶解物進行超濾分離，對比其氨基酸組成，研究超濾前后亞麻籽肽的降膽固醇效果，為亞麻籽餅的深加工利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

低溫壓榨亞麻籽餅(粗蛋白質含量40%)，內蒙古豐吉妙農業(yè)產品科技開發(fā)有限公司；Protease M(51.5 AU/g)，日本天野酶制劑株式會社； 堿性蛋白酶(Alcalase，10 000 U/g)，諾維信(中國)生物技術有限公司；木瓜蛋白酶(Papain，12 000 U/g)，北京中生瑞泰科技有限公司；胰蛋白酶(Trypsin，6 000 U/g)、?；悄懰徕c、膽固醇，美國Sigma公司；氫氧化鈉、鹽酸、氯化鈉、磷酸氫二鈉等均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為分析純。

1.1.2 儀器與設備

HJ-6電熱恒溫水浴鍋，上海福瑪實驗設備有限公司；PHSJ-4A酸度計，上海雷磁儀電科學儀器股份有限公司；TDL-5-A離心機，上海安亭科學儀器廠；HJ-1磁力攪拌器，江蘇金壇榮華儀器有限公司；TAS-986紫外分光光度計，北京普析通用儀器公司；LGJ-25C凍干機，北京四環(huán)科技有限公司；BCD-223MTX新飛冷藏冷凍冰箱，河南新飛電器有限公司；Millipore8200超濾杯，美國Millipore公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 亞麻籽分離蛋白的制備

參照鄭睿[12]的方法制備亞麻籽分離蛋白。將低溫壓榨亞麻籽餅粉碎、脫脂處理。稱取20 g低溫脫脂亞麻籽粉，按料液比1∶35加入去離子水，50℃下恒溫提取2 h，離心(4 000 r/min，15 min)去除沉淀物，調節(jié)pH 至4.4，靜置1 h后離心去除上清液，使用少量去離子水洗滌沉淀2次，調節(jié)pH 7.0，凍干得亞麻籽分離蛋白。

1.2.2 亞麻籽降膽固醇活性肽的制備

稱取一定量亞麻籽分離蛋白，以去離子水配制成一定質量分數(shù)的亞麻籽蛋白溶液，調節(jié)pH，加入蛋白酶，攪拌均勻，置于一定溫度水浴鍋中恒溫酶解一定時間，酶解結束后90℃滅酶15 min，4 000 r/min 下離心15 min，所得上清液即為亞麻籽分離蛋白酶解液，冷凍干燥備用。

1.2.3 水解度的測定

采用pH-stat法測定酶解物的水解度[13-14]。

1.2.4 膽固醇膠束溶解度抑制率的測定

采用劉麗媛等[15]的方法并加以改進。

膽固醇標準溶液曲線的繪制[16]：配制膽固醇標準使用液，吸取0～8 mL分別置于25 mL具塞試管中。將各具塞試管用冰醋酸定容至8 mL，加入4 mL鐵礬顯色劑，振蕩均勻，靜置30 min，采用紫外分光光度計于560 nm波長處測定OD值，并繪制標準曲線，得到標準曲線方程：Y=0.014 3x+0.041 9，R2=0.990 9(x為膽固醇質量濃度，mg/L；Y為OD值)。

稱取5 mg亞麻籽分離蛋白酶解物，溶解在1 mL膠束溶液(10 mmol/L?；悄懰徕c，0.4 mmol/L膽固醇，1 mmol/L油酸，132 mmol/L NaCl，15 mmol/L磷酸鈉緩沖液(pH 7.4))中。對膠束溶液采用超聲波降解法(超聲波均質器)處理，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，用超高速離心機15 000 r/min下離心60 min。收集上清液，采用紫外分光光度計于560 nm波長處測定OD值，按標準曲線方程計算膽固醇質量濃度。以不加亞麻籽蛋白酶解物的溶液為空白，根據下式計算膽固醇膠束溶解度抑制率。

膽固醇膠束溶解度抑制率=(S0-S1)/S0×100%

式中：S0為空白溶液膽固醇的質量濃度，mg/L；S1為樣品溶液膽固醇的質量濃度，mg/L。

1.2.5 亞麻籽降膽固醇活性肽的超濾分離

采用截留相對分子質量為10、5、3、1 kDa的超濾膜將亞麻籽分離蛋白酶解液分為5個組分(≥10 kDa,5～10 kDa,3～5 kDa,1～3 kDa,<1 kDa)，收集各組分，凍干，測定各組分的膽固醇膠束溶解度抑制率。

1.2.6 亞麻籽肽氨基酸組成分析

稱取0.5 g亞麻籽肽粉于水解管中，加入10 mL濃度為6 mol/L的HCl溶液，于真空狀態(tài)下迅速封管，110℃下水解24 h，用少量去離子水將水解物轉入到25 mL容量瓶中，定容。取5 mL過濾后的水解液進行真空干燥，加入2 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH 2.2)對其進行溶解，振蕩混勻后過0.22 μm濾膜，轉移至進樣瓶。采用氨基酸自動分析儀對亞麻籽肽的氨基酸組成進行測定。

2 結果與討論

2.1 蛋白酶的篩選

在加酶量1%(以底物質量計)、底物質量分數(shù)2.0%，各酶的最適條件下對亞麻籽分離蛋白進行酶解，不同蛋白酶酶解亞麻籽分離蛋白的水解度見圖1。

注：堿性蛋白酶最適溫度為55℃，最適pH為8.0；木瓜蛋白酶最適溫度為50℃，最適pH為7.4；胰蛋白酶最適溫度為37℃，最適pH為8.0；Protease M最適溫度為50℃，最適pH為3.0。

圖1 不同蛋白酶酶解亞麻籽分離蛋白的水解度

由圖1可知，4種蛋白酶的水解趨勢較為接近，即在酶解初期，亞麻籽分離蛋白的水解度隨時間延長而逐漸增大，繼續(xù)延長時間水解度逐漸趨于穩(wěn)定，最后酶解停止。木瓜蛋白酶在酶解3 h時接近最大酶解程度，水解度達7.7%；Protease M在酶解6 h時酶解接近停止，水解度達14.6%；堿性蛋白酶酶解程度最大，酶解4 h時，水解度為木瓜蛋白酶的3倍左右，為Protease M的2倍左右，酶解6 h時，酶解接近停止，水解度達29.66%。不同蛋白酶對同種底物的酶解程度存在較大差異，相同時間蛋白酶的水解度排序為堿性蛋白酶>胰蛋白酶>Protease M>木瓜蛋白酶。

在最適條件下，對4種蛋白酶酶解亞麻籽分離蛋白得到的酶解物進行降膽固醇活性檢測，結果見圖2。

圖2 不同酶酶解后酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率

由圖2可知，Protease M在酶解4 h時的酶解物膽固醇膠束溶解度抑制率最高，達43.71%，明顯高于其他3種酶的酶解物 (p<0.05)，木瓜蛋白酶在酶解2 h時的抑制率最高，達36.25%。Protease M在酶解4 h后對膽固醇膠束溶解度的抑制程度明顯高于其他酶，因此選擇Protease M進行酶解較為理想。

2.2 Protease M酶解亞麻籽分離蛋白單因素實驗

2.2.1 加酶量的確定

固定底物質量分數(shù)為2.0%，酶解溫度為50℃，酶解pH為 3.0，添加0.5%～2.5%的Protease M酶解4 h，測定不同加酶量下酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率，結果見圖3。

圖3 加酶量對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響

由圖3可以看出：當固定底物質量分數(shù)后，加酶量發(fā)生變化時，膽固醇膠束溶解度抑制率隨之改變，當加酶量在0.5%～1.0% 時，隨加酶量的增大，亞麻籽分離蛋白逐漸酶解充分，生成具有降膽固醇活性的多肽，抑制率呈現(xiàn)上升狀態(tài)；當加酶量達到1.0%時，亞麻籽分離蛋白酶解物的降膽固醇活性達到最強，抑制率為43.71%；當加酶量繼續(xù)增加時，大分子多肽被水解為小分子肽段或氨基酸，降膽固醇活性肽減少，抑制率下降。因此，最適加酶量確定為1.0%。

2.2.2 底物質量分數(shù)的確定

固定酶解溫度為50℃，酶解pH為3.0，加酶量為1.0%，改變底物質量分數(shù)為0.5%～4.0%，酶解4 h，測定不同底物質量分數(shù)下酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率，結果如圖4所示。

圖4 底物質量分數(shù)對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響

由圖4可以看出，當?shù)孜镔|量分數(shù)在0.5%～2.0%時，隨底物質量分數(shù)的增加，膽固醇膠束溶解度抑制率呈現(xiàn)較為明顯的上升趨勢。底物質量分數(shù)為2.0%時，亞麻籽分離蛋白酶解物的降膽固醇活性最強，抑制率達41.75%。當?shù)孜镔|量分數(shù)繼續(xù)增加時，抑制率開始下降。這可能是因為底物質量分數(shù)過高時，沒有足夠的蛋白酶與其反應生成大量具有降膽固醇活性的肽[17]，同時由于濃度增大，溶液黏稠度上升，酶與底物作用面積變小，酶解效率降低，抑制率下降[18]。在此反應體系中，底物質量分數(shù)過高或過低都不利于亞麻籽蛋白活性肽的制備。因此，最適底物質量分數(shù)確定為2.0%。

2.2.3 酶解溫度的確定

固定底物質量分數(shù)為2.0%，酶解pH為3.0，加酶量為1.0%，控制酶解溫度為30～70℃，酶解4 h，測定不同酶解溫度下酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率，結果如圖5所示。

由圖5可知，當酶解溫度在30～50℃時，隨酶解溫度的升高，膽固醇膠束溶解度抑制率呈現(xiàn)上升趨勢。酶解溫度為50℃時，達到蛋白酶的最適酶解溫度，亞麻籽分離蛋白酶解物的降膽固醇活性最強，抑制率為46.75%。當酶解溫度繼續(xù)升高時，蛋白酶活力受到影響，蛋白的水解程度降低，活性肽的含量減少，酶解物的降膽固醇活性開始下降。因此，最適酶解溫度確定為50℃。

圖5 酶解溫度對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響

2.2.4 酶解時間的確定

固定底物質量分數(shù)為2.0%，酶解pH為3.0，加酶量為1.0%，酶解溫度為50℃，分別酶解1、2、3、4、5、6 h，測定不同酶解時間下酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率，結果如圖6所示。

圖6 酶解時間對膽固醇膠束溶解度抑制率的影響

由圖6可知，當酶解時間在1～4 h時，隨著酶解時間的延長，膽固醇膠束溶解度抑制率呈現(xiàn)上升趨勢。酶解時間為4 h時，亞麻籽分離蛋白酶解物的降膽固醇活性最強，抑制率為47.98%。繼續(xù)延長酶解時間，抑制率呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。有研究表明，蛋白的水解過程中在酶的作用下蛋白質長鏈被打開，形成長度不同的小分子肽段[19]。亞麻籽分離蛋白酶解物的降膽固醇活性可能與蛋白質經酶解后暴露出來的某些氨基酸殘基有關。因此，最適酶解時間確定為4 h。

2.3 Protease M酶解亞麻籽分離蛋白正交實驗

在單因素實驗的基礎上，固定酶解pH 3.0，選擇加酶量 (A)、底物質量分數(shù)(B)、酶解溫度(C)、酶解時間(D)為考察因素，各取3個水平，以膽固醇膠束溶解度抑制率為指標，利用L9(34) 正交表設計正交實驗，對酶解亞麻籽分離蛋白制備降膽固醇活性肽的工藝進行優(yōu)化。正交實驗因素水平見表1，正交實驗設計及結果見表2。

表1 正交實驗因素水平

表2 正交實驗設計及結果

由表2可知，各因素對酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率的影響大小依次為A>B>D>C，即加酶量>底物質量分數(shù)>酶解時間>酶解溫度。最優(yōu)水平組合為A3B2C2D1，即加酶量1.5%，底物質量分數(shù)2.0%，酶解溫度50℃，酶解時間3 h。在最優(yōu)酶解條件下進行驗證實驗，膽固醇膠束溶解度抑制率達到53.19%。

2.4 亞麻籽降膽固醇活性肽的超濾分離

采用截留相對分子質量為10、5、3、1 kDa的超濾膜對亞麻籽分離蛋白酶解液進行分離，對各組分的得率和降膽固醇活性進行評價，結果見表3。

表3 亞麻籽分離蛋白酶解液超濾后各組分的得率與膽固醇膠束溶解度抑制率

由表3可知：亞麻籽分離蛋白酶解液經超濾分離后，Y3組分(相對分子質量范圍為3～5 kDa)得率最高，為28.9%，但該組分的降膽固醇活性較弱，膽固醇膠束溶解度抑制率僅為27.07%；Y5組分(相對分子質量范圍為1 kDa以下)降膽固醇活性最強，膽固醇膠束溶解度抑制率高達72.39%，且該組分的得率達到20.5%。張宇等[20]采用超濾技術純化了乳清蛋白肽，比較了超濾前后水解溶液的降膽固醇活性，表明超濾分離技術可以有效分離小分子肽，得到膽固醇膠束溶解度抑制率較高的組分。

2.5 超濾前后亞麻籽肽的氨基酸組成

采用氨基酸自動分析儀對超濾前酶解物和超濾后小于1 kDa多肽組分的氨基酸組成進行分析，結果見表4。

表4 超濾前后亞麻籽肽的氨基酸組成及含量 %

由表4可知，超濾后亞麻籽肽中各疏水性氨基酸的含量均有所提高，總疏水性氨基酸含量由15.89% 提升到31.86%，提高了15.97個百分點。國內外研究表明，肽的降膽固醇活性與其含有的疏水區(qū)有一定的相關性[21]。本研究中超濾后相對分子質量小于1 kDa的多肽組分的疏水性氨基酸苯丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸的含量分別達到了4.87%、5.07%、5.06%、5.58%，均明顯高于超濾前。許多文獻研究認為降膽固醇活性較強的多肽蛋氨酸/甘氨酸和賴氨酸/精氨酸的比值較小[22]。本實驗中超濾前后亞麻籽肽蛋氨酸/甘氨酸與賴氨酸/精氨酸的比值分別為0.26、0.32和0.27、0.17，超濾后相對分子質量小于1 kDa的多肽組分的賴氨酸/精氨酸的比值明顯低于超濾前。

3 結 論

本實驗通過蛋白酶酶解亞麻籽分離蛋白，制備降膽固醇活性肽。對蛋白酶進行了篩選，以體外膽固醇膠束溶解度抑制率為指標，通過單因素實驗和正交實驗優(yōu)化酶解工藝。結果表明，最佳酶解工藝條件為采用Protease M進行酶解、加酶量1.5%、底物質量分數(shù)2.0%、酶解溫度50℃、酶解時間3 h，在此條件下酶解物的膽固醇膠束溶解度抑制率為53.19%。對最優(yōu)工藝下得到的酶解液進行超濾純化，測定超濾后不同組分的膽固醇膠束溶解度抑制率，可知相對分子質量范圍小于1 kDa的多肽組分降膽固醇活性最強，膽固醇膠束溶解度抑制率達72.39%。氨基酸組成分析表明，相對分子質量小于1 kDa的多肽組分總疏水性氨基酸含量明顯高于超濾前，賴氨酸/精氨酸的比值也明顯低于超濾前。