金銀花中有機磷農(nóng)藥殘留分析及其沖泡過程遷移模型研究

李建勛， 王玉珍， 盧 嘉， 徐 迪， 單吉浩， 范 蓓

(中國農(nóng)業(yè)科學院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 北京 100193)

金銀花(Lonicerajaponica)又名忍冬花，是忍冬科多年生植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，藥食兩用，為常用大宗中藥材。金銀花中主要化學成分有色素、有機酸類、揮發(fā)油類、黃酮類等和微量元素，其性寒、味甘，具有清熱解毒、消炎去腫等功效[2]，常用于溫病發(fā)熱，熱毒癰瘍和腫瘤等癥，近年來研究發(fā)現(xiàn)其對治療肺癆也有顯著效果[3-4]。此外，金銀花作為一種茶飲料頗受消費者喜愛，除了可以直接泡茶飲用之外，還開發(fā)出多種茶飲品，如王老吉、和其正等。

金銀花在種植過程中經(jīng)常遭受病蟲害導致產(chǎn)量和品質的下降，茶農(nóng)會通過噴灑大量農(nóng)藥治理病蟲害[5-7]。有機磷農(nóng)藥具有殺蟲效率高、范圍廣、價格低廉的特點，其消費量居各類農(nóng)藥首位，其中對硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷等有機磷農(nóng)藥在金銀花種植過程中使用較為頻繁，殘留現(xiàn)象常常發(fā)生[8-9]。顧炎等[10]通過對市售金銀花樣品檢測發(fā)現(xiàn)，60份金銀花樣品中有23份樣品檢出有機磷農(nóng)藥，超標農(nóng)藥達11種；鄭雙雙等[11]發(fā)現(xiàn)金銀花樣品受到有機磷農(nóng)藥污染嚴重，不合格率達60%，有機磷農(nóng)藥殘留已經(jīng)成為影響金銀花質量安全的嚴重問題之一。目前，人們已養(yǎng)成用開水沖泡金銀花直接飲用茶湯的習慣，而金銀花中殘留的農(nóng)藥會通過沖泡遷移入茶湯中而被人體直接吸收，Cao等[12]研究發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥在茶葉沖泡過程中的遷移率從0.7%(毒死蜱)到90.1%(甲胺磷)不等。不同有機磷農(nóng)藥因具有不同的理化性質，沖泡過程中具有不同的遷移能力，從而對人體健康的影響也不盡相同。因此確定農(nóng)藥從金銀花到茶湯中的遷移率并建立遷移預測模型具有重要意義。

研究通過QuEChERS-GC-MS/MS快速測定金銀花和茶湯中6種有機磷農(nóng)藥(對硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷)殘留，優(yōu)化了凈化劑填料組合，并深入研究金銀花在沖泡過程中農(nóng)藥的遷移規(guī)律，建立遷移預測模型，旨在為我國制定金銀花中有機磷農(nóng)藥最大殘留限量標準提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

有機磷農(nóng)藥(對硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷)標準品，天津阿爾塔科技有限公司；乙腈、乙酸銨、乙酸乙酯，均為色譜純，國藥集團化學試劑北京有限公司；乙二胺-N-丙基硅烷化硅膠(PSA)、多壁碳納米管(MWCNTs)(ID:5～10 nm, OD:10～20 nm, Length: 10～30 μm)，北京華威銳科化工有限公司；氯化鈉、無水硫酸鎂，均為分析純，北京鵬彩精細化工有限公司。實驗用水為經(jīng)Milli- Q型凈化系統(tǒng)過濾的超純水。

1.2 儀器與設備

7890A- 7000C型氣相色譜- 串聯(lián)質譜儀，美國安捷倫科技有限公司；LYNX6000型高速冷凍離心機，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；PX2242H型精密天平，奧豪斯儀器(上海)有限公司；Vortex- Genie 2型渦旋混合器，美國Scientific公司；3K15型離心機，美國Sigma公司；Milli- Q型純水儀，美國Millipore 公司。

1.3 實驗方法

1.3.1標準溶液的配制

分別準確稱取10 mg有機磷農(nóng)藥標準品于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，得到1 000 μg/mL的標準儲備液；用儲備液配制質量濃度為10 μg/mL的混合標準中間液，均于-18 ℃冰箱保存待用。用空白基質溶液將混合標準中間液逐級稀釋成 1 000、500、200、100、50、10、5、1 μg/L 的基質匹配標準工作溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.2金銀花污染樣品制備

采用室內(nèi)制備污染金銀花樣品的方式，取新購置的金銀花樣品500 g，均勻平鋪，用噴壺將10 mL質量濃度為2 μg/mL的6種有機磷農(nóng)藥混合標準溶液均勻地噴灑在金銀花表面，靜置20 min晾干后，將樣品粉碎，置于密封袋混勻，于4 ℃冰箱內(nèi)冷藏備用。

1.3.3金銀花茶湯制備

取3.0 g制備好的金銀花放入250 mL燒杯中，加入150 mL沸水浸泡10 min，過濾后冷卻，得到第一批茶湯樣品。然后重復沖泡2次，分別獲得第二批和第三批茶湯樣品，使用3批茶湯的農(nóng)藥殘留量之和計算農(nóng)藥遷移率(transfer rate，TR)。

1.3.4樣品前處理

金銀花樣品前處理：參照林濤等[13]方法，準確稱取(2.0±0.1)g金銀花于50 mL離心管中，加入10 mL水和10 mL乙腈，渦旋振蕩1 min后，加入1 g氯化鈉和4 g無水硫酸鎂，渦旋振蕩1 min，于5 000 r/min離心5 min，取1 mL上清液于含有10 mg MWCNTs、15 mg PSA、150 mg 無水硫酸鎂的2 mL離心管中，渦旋振蕩2 min，于12 000 r/min離心1 min，取上清液過0.22 μm濾膜，進GC-MS/MS分析。

茶湯樣品前處理：準確量取10 mL沖泡制得的茶湯樣品直接加入10 mL乙酸乙酯進行提取，其余步驟同金銀花提取步驟。

1.3.5儀器條件設定

色譜條件：Rxi-5MS色譜柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)。升溫程序：40 ℃保持1 min，以40 ℃/min升溫至120 ℃，再以5 ℃/min升溫至240 ℃，最后以12 ℃/min升溫至300 ℃，保持6 min。載氣：氦氣，流速1.0 mL/min。進樣體積：1 μL。

質譜條件：電子轟擊離子源(EI)，離子源溫度280 ℃，傳輸線溫度280 ℃，溶劑延遲時間3 min，采集模式為多反應監(jiān)測(MRM)模式；每種目標物選擇豐度較高的2個碎片離子分別作為定量和定性離子，并優(yōu)化每個目標物的最佳碰撞能(CE)，以獲得檢測的最佳靈敏度。6種有機磷農(nóng)藥的理化性質(水溶解度(Ws)和正辛醇- 水分配系數(shù)(Kow))及具體質譜參數(shù)見表1。

表1 6種有機磷農(nóng)藥的理化性質和質譜參數(shù)

*為定量離子。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0以及Excel軟件進行數(shù)據(jù)處理及分析，Origin 8.6軟件進行圖表的繪制。

2 結果與分析

2.1 凈化劑填料配比選擇

金銀花基質復雜，含有色素、生物堿、有機酸等有機成分[14-18]，大大增加了對目標物提取凈化和分析檢測的難度。PSA能夠清除金銀花中的極性親脂性色素、脂肪酸和糖類等極性成分，而MWCNTs比表面積大，具有中空結構，故吸附性能優(yōu)良，目前廣泛應用于各類食品中的農(nóng)藥殘留檢測[19-21]。

實驗參照Wang等[22]的實驗方案并做出一定的改進。使用的凈化填料種類為無水硫酸鎂、PSA、MWCNTs，對3種填料的4種不同配比進行優(yōu)化，具體方案為：(1)10 mg MWCNTs、15 mg PSA、150 mg無水硫酸鎂；(2)20 mg MWCNTs、30 mg PSA、150 mg無水硫酸鎂;(3)50 mg MWCNTs、150 mg無水硫酸鎂；(4)30 mg MWCNTs、45 mg PSA、150 mg無水硫酸鎂。盡可能使填料更多地吸附有機雜質而將待檢測的目標化合物保留在提取液中，每組進行6次平行實驗，結果如圖1。采用方案(3)或(4)時，倍硫磷和丙溴磷的回收效果均明顯低于方案(1)和(2)，且精密度較差；采用方案(1)或(2)時，6種有機磷農(nóng)藥回收率均≥85%，且相對標準偏差(RSD)≤4.96%，回收率和精密度均令人滿意；綜合比較方案(1)和方案(2)，秉承節(jié)約資源、降低成本的理念，填料方案(1)為較佳選擇。

圖1 不同凈化劑組合下6種有機磷農(nóng)藥的回收率Fig.1 Recoveries of 6 organophosphorus pesticides under different combinations of purification fillers

2.2 驗證結果分析

2.2.1線性范圍與定量限分析

每種有機磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中受到的基質效應根據(jù)其在各基質匹配標準溶液和溶劑標準溶液中的響應比值來計算，添加質量濃度為50 μg/L，結果見表2。不同有機磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中受到了不同程度的基質效應，均表現(xiàn)為基質增強效應，因此需要采用基質匹配標準曲線對目標物進行準確定量。配制 1、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/kg的金銀花基質匹配標準工作溶液和1、5、10、50、100、200、500、1 000 μg/L的茶湯基質匹配標準工作溶液，以信噪比(S/N=10)為定量限，按1.3.5中的質譜條件進樣分析，繪制標準曲線。6種有機磷農(nóng)藥在金銀花與茶湯中的線性范圍與定量限見表2。由表2可知，在金銀花和茶湯中，倍硫磷、特丁硫磷、丙溴磷、治螟磷和滅線磷分別在1～1 000 μg/kg和1～1 000 μg/L均具有良好的線性關系，R2>0.991；在茶湯中，對硫磷在10～1 000 μg/L呈現(xiàn)較好的線性關系，這是由于對硫磷在茶湯中定量限較高，為10 μg/L；而其他農(nóng)藥在茶湯中定量限均為1 μg/L。說明該方法具有較高的靈敏度。

2.2.2準確度和精密度分析

按照QuEChERS方法對金銀花和茶湯進行加標回收實驗，金銀花選取1、10、50、100 μg/kg四個水平，而茶湯選取1、8、40、80 μg/L四個水平，分別以回收率和相對標準偏差評價方法的準確度和精密度，每組平行實驗6次，結果見表3。由表3可知，6種有機磷農(nóng)藥在4個添加水平的回收率介于65.6%～110.3%，且RSD≤18.26%，方法準確度和精密度良好，可以應用于實際樣品中目標化合物檢測。圖2為金銀花和茶湯中6種有機磷農(nóng)藥的MRM色譜，其中金銀花中農(nóng)藥添加水平為10 μg/kg，茶湯中添加水平為8 μg/L。

表2 6種有機磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中的線性方程和基質效應

表3 6種有機磷農(nóng)藥在金銀花與茶湯中的回收率

2.3 金銀花浸泡過程農(nóng)藥遷移模型分析

2.3.1農(nóng)藥遷移率實驗結果

實驗采用了人們?nèi)粘ｏ嫴璩Ｓ玫臎_泡方式，以1.3.3節(jié)方法研究6種有機磷農(nóng)藥在金銀花沖泡過程中的遷移規(guī)律。為消除制備污染樣品時農(nóng)藥分布不均勻的情況，在噴灑后粉碎混勻。由于農(nóng)藥會揮發(fā)，因此需在沖泡實驗前測定其原始含量，平行實驗6次。6種農(nóng)藥對硫磷、倍硫磷、特丁硫磷、治螟磷、丙溴磷和滅線磷在沖泡過程前的原始含量分別為95.94、70.34、64.53、129.11、70.34、162.11 μg/kg，沖泡3次的遷移率結果見表4。結果表明，在第一、二、三批沖泡過程中，6種農(nóng)藥的遷移率分別介于14.0%～49.8%、5.7%～21.8%和4.7%～21.4%，且隨著沖泡次數(shù)增加，遷移率逐漸降低。6種農(nóng)藥經(jīng)過3批沖泡后總遷移率在25.1%～84.6%，其中對硫磷、倍硫磷、治螟磷和滅線磷的總遷移率都大于60%；并且在第一批沖泡過程中，對硫磷和滅線磷從金銀花向茶湯遷移的比率均較高，在45%以上，也就是近一半的農(nóng)藥遷移到茶湯中；特丁硫磷和丙溴磷3批次總遷移率均低于30%。由此可見，在日常金銀花沖泡過程中，殘留農(nóng)藥會以一定比例遷移至茶湯中，尤其是有機磷這種水溶性較高的農(nóng)藥，遷移率相對較高，對常飲用金銀花茶湯的人群的身體健康產(chǎn)生潛在的威脅。

圖2 6種有機磷農(nóng)藥在金銀花和茶湯中的MRM色譜Fig.2 MRM chromatogram of 6 organophosphorus pesticides in honeysuckle and tea infusion

表4 6種有機磷農(nóng)藥在茶湯中的遷移率

2.3.2農(nóng)藥遷移模型的建立

金銀花中農(nóng)藥遷移入茶湯中取決于水溶解度(Ws)[23]、正辛醇- 水分配系數(shù)(Kow)[22-28]和金銀花的特性[29]，遷移率還與金銀花中農(nóng)藥的殘留量、沖泡溫度、沖泡時間、沖泡次數(shù)等有著密切關系。本研究參考Wang等[22]的泡茶方式，使用100 ℃沸水沖泡金銀花粉碎樣品15 min，沖泡3次計算其總遷移率。6種有機磷農(nóng)藥的Ws及Kow的對數(shù)值見表1，根據(jù)表1可以看出這6種有機磷農(nóng)藥極性分布廣，建立的模型適用性較強。通過分析農(nóng)藥遷移率與Kow及Ws之間的關系，建立了金銀花沖泡過程中有機磷農(nóng)藥的遷移模型，如圖3。通過分析lg Kow、lg Ws與lg TR之間的線性關系，發(fā)現(xiàn)lg Kow與6種農(nóng)藥遷移率的關聯(lián)性較顯著，且呈負相關，通過Origin 8.6擬合出線性方程lg TR=-0.536 2 lg Kow+3.915 2(lg Kow>3)，R2=0.914，見圖3(a)；研究也證實了lg Ws與6種農(nóng)藥遷移率未表現(xiàn)出明顯的關聯(lián)性，見圖3(b)。但需要指出由于本研究6種農(nóng)藥的lg Kow均大于3，因此本預測模型只適用于lg Kow>3的有機磷農(nóng)藥，有一定的范圍要求。該遷移預測模型可以對有機磷農(nóng)藥的潛在遷移率進行預測，從而更科學地評價金銀花的飲用風險。

圖3 6種有機磷農(nóng)藥正辛醇- 水分配系數(shù)、水溶解度與遷移率的關系Fig.3 Relationship between Kow, Ws and transfer rate of 6 organophosphorus pesticides

通過農(nóng)藥遷移模型的建立，還可為日常飲茶者提供一些建議，在保證金銀花營養(yǎng)品質和風味的前提下，棄去第一批短時間沖泡的茶湯，再進行第二、三批泡茶飲用，從而顯著降低茶湯中的農(nóng)藥殘留，達到“洗茶”的目的，有效降低對人類健康的威脅。

3 結 論

建立了QuEChERS-GC-MS/MS法快速測定金銀花和茶湯中6種有機磷農(nóng)藥殘留的方法。通過優(yōu)選MWCNTs、PSA和無水硫酸鎂的填料組合，有效去除了金銀花基質中的雜質，具有較好的準確性和精密度。該方法操作簡單、靈敏度高，適合金銀花中6種有機磷農(nóng)藥殘留的快速檢測。研究了金銀花在沖泡過程中6種有機磷農(nóng)藥的遷移規(guī)律，建立了遷移模型lg TR=-0.536 2lg Kow+3.915 2(lg Kow>3)。模型表明農(nóng)藥的遷移率與正辛醇-水分配系數(shù)具有顯著關聯(lián)性，與水溶解度無明顯關聯(lián)性。本研究以期為我國制定金銀花中有機磷農(nóng)藥殘留最大殘留限量標準提供理論依據(jù)，并為建立其他茶飲料(如咖啡、可可、菊花、玫瑰和香草等)的有機磷農(nóng)藥遷移模型提供一定的參考。