苦參堿對(duì)乙醛活化的肝星狀細(xì)胞CFSC-8B增殖和膠原合成的影響及機(jī)制研究

中圖分類號(hào) R962 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2020）11-1353-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2020.11.12

摘 要 目的：研究苦參堿對(duì)乙醛活化的大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B增殖和膠原合成的影響，并探討其可能的作用機(jī)制。方法：取體外培養(yǎng)的CFSC-8B細(xì)胞，分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（2.5 μmol/L秋水仙堿）和苦參堿低、中、高濃度組（30、60、120? ? ? μmol/L）。除空白對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均加入200 μmol/L乙醛溶液誘導(dǎo)活化，并同時(shí)加入相應(yīng)藥液（空白對(duì)照組和模型組加入等體積空白培養(yǎng)液），共同作用24 h后，采用CCK-8法檢測各組細(xì)胞的存活率。另取細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（2.5 μmol/L秋水仙堿）和苦參堿中、高濃度組（60、120 μmol/L），同法活化和加藥處理。分別采用酶消化法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中羥脯氨酸（Hyp）含量;采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）和Ⅲ型膠原蛋白（Col-Ⅲ）含量;采用實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法檢測細(xì)胞中α-平滑肌激動(dòng)蛋白（α-SMA）、轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）、TGF-β1Ⅰ型受體（TβR-Ⅰ）、TGF-β1Ⅱ型受體（TβR-Ⅱ）、Smad3、Smad4和Smad7 mRNA表達(dá)水平;采用 Western blotting法檢測細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4和Smad7蛋白表達(dá)水平。結(jié)果：與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞存活率顯著升高（P<0.05）;細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量和細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3和Smad4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），細(xì)胞中Smad7 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與模型組比較，陽性對(duì)照組和苦參堿中、高濃度組細(xì)胞存活率和細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量以及細(xì)胞中α-SMA、Smad4 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），細(xì)胞中Smad7 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;陽性對(duì)照組和苦參堿高濃度組細(xì)胞中TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3 mRNA及其蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05）。與苦參堿中濃度組比較，苦參堿高濃度組細(xì)胞各指標(biāo)水平改善程度均更顯著（P<0.05）。結(jié)論：苦參堿能抑制乙醛活化的CFSC-8B細(xì)胞的增殖和膠原合成，且具有一定的濃度依賴性;其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路的傳導(dǎo)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 苦參堿;肝星狀細(xì)胞;增殖;膠原合成;轉(zhuǎn)化生長因子β1/Smad通路;機(jī)制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of matrine on proliferation and collagen synthesis of rat hepatic stellate cells CFSC-8B activated by acetaldehyde， and to investigate its possible mechanism. METHODS： CFSC-8B cells cultured in vitro were divided into blank control group， model group， positive control group （2.5 μmol/L colchicine） and matrine low， medium and high concentration groups （30， 60， 120 μmol/L）. Except for blank control group， other groups were activated with 200 μmol/L acetaldehyde for 24 h; medicine groups were intervened with relevant medicine for 24 h （blank control group and model group were intervened with equal volume blank medium）. Survival rate of cell was detected by CCK-8 assay.? Cells were divided into blank control group， model group， positive control group （2.5 μmol/L colchicine）， matrine medium and high concentration groups （60， 120 μmol/L）， then activated and treated with same method. Hydroxyprolin （Hyp） content in cell culture solution was tested by enzyme digestion. The contents of Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell culture solution were determined by ELISA. mRNA expressionss of α-SMA，TGF-β1，TβR-?， TβR-Ⅱ， Smad3， Smad4 and Smad7 in cells were detected by RT-PCR. The protein expressions of α-SMA， TGF-β1， TβR-Ⅰ， TβR- Ⅱ， Smad3， Smad4 and Samd7 in cells were detected by Western blotting. RESULTS： Compared with blank control group， survival rate of cells in model group was increased significantly （P<0.05）; the contents of Hyp， Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell culture solution， mRNA and its protein expressions of α-SMA， TGF-β1， TβR-Ⅰ， TβR-Ⅱ， Smad3， Smad4 in cells were increased significantly in model group （P<0.05）， while the mRNA and protein expression of Smad7 was decreased significantly （P<0.05）. Compared with model group， survival rate of cells， the contents of Hyp， Col-Ⅰ and Col-Ⅲ in cell culture solution， the mRNA and protein expressions of α-SMA and Smad4 were decreased significantly in positive control group and matrine medium and high concentration groups（P<0.05）， while the mRNA and protein expression of Smad7 was increased significantly （P<0.05）; the mRNA and protein expressions of TGF-β1， TβR-Ⅰ， TβR-Ⅱ and Smad3 were decreased significantly in positive control group and matrine high concentration group （P<0.05）. Compared with matrine medium concentration group， all above indexes were improved significantly in matrine high concentration group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Matrine can suppress the proliferation and collagen synthesis of CFSC-8B cells activated by acetaldehyde， with a centain concentrlation dependence， the mechanism of which may be associated with regulating the conduction of TGFβ/Smad signal pathway.

KEYWORDS? ?Matrine; Hepatic stellate cells; Proliferation; Collagen synthesis; TGF-β1/Smad pathway; Mechanism

肝纖維化是肝硬化的必經(jīng)階段，也是肝細(xì)胞癌的前兆[1]。在遺傳性或非遺傳性損傷因素的慢性刺激下，肝臟內(nèi)處于靜止期的肝星狀細(xì)胞被激活，轉(zhuǎn)化成為肌成纖維樣細(xì)胞后，分泌多種促炎因子/促纖維因子，合成α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-SMA），并產(chǎn)生大量以Ⅰ型膠原蛋白（Col-Ⅰ）、Ⅲ型膠原蛋白（Col-Ⅲ）為主的肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）成分，ECM在肝臟內(nèi)過度沉積，繼而造成肝纖維化[2]。引起肝纖維化的因素包括肝炎病毒、血吸蟲病、酒精、藥物、膽汁淤積及自身代謝疾病等[3]。研究顯示，由酒精性肝損傷造成的肝纖維化的發(fā)生率逐年升高[4]。因此，尋找有效防治酒精性肝纖維化的藥物，以防止其發(fā)展成肝硬化甚至肝癌，具有重要的臨床意義。

中藥苦參為豆科植物苦參（Sophora flavescens Ait.）的干燥根，具有抗菌、抗病毒、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、保肝等多種藥理作用[5-6]?？鄥A是苦參中的有效成分之一，在臨床上已被應(yīng)用于病毒性肝炎的治療[7-8]，但其對(duì)酒精性肝損傷造成的肝纖維化是否存在逆轉(zhuǎn)作用尚未見報(bào)道。轉(zhuǎn)化生長因子β1（TGF-β1）/Smad信號(hào)通路在肝膠原合成與肝纖維化發(fā)展過程中起著關(guān)鍵性的作用[9]。因此，本研究以乙醛活化的大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B為模型，探討苦參堿對(duì)活化后肝星狀細(xì)胞增殖和膠原合成的影響，并從TGF-β1/Smad信號(hào)通路著手探究其可能的作用機(jī)制，為苦參堿的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;3111型二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;UV-2550型紫外分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司）;XPE504型分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）;ELX800型全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國Bio-Tek公司）;Countess C10227型細(xì)胞計(jì)數(shù)器（美國Invitrogen公司）;5417R型離心機(jī)（德國Eppendorf公司）;Stratagene Mx3005P 型實(shí)時(shí)熒光定量-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）儀（美國Agilent公司）;SmartChemi Ⅱ型一體式化學(xué)發(fā)光成像儀（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）;HL-2000型分子雜交箱（美國UVP公司）;JY-ZY2型轉(zhuǎn)移電泳槽、JY-CZ1型單垂直電泳槽（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

苦參堿對(duì)照品 （中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：140905，純度：≥98%）;秋水仙堿片（西雙版納藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：H53021369，規(guī)格：0.5 mg）;CCK-8細(xì)胞活力檢測試劑盒、肝組織羥脯氨酸（Hyp）檢測試劑盒以及Col-Ⅰ、Col-Ⅲ酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)：20190401、20181205、20181210、20181210）;細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒（北京碧云天生物技術(shù)公司，批號(hào)：P0028-1）;RNA抽提試劑盒（美國Ambion公司，批號(hào)：47323）;超敏發(fā)光（ECL）檢測試劑盒[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，批號(hào)：RG239143];兔抗鼠α-SMA多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1Ⅰ型受體（TβR-Ⅰ）多克隆抗體、兔抗鼠TGF-β1多克隆抗體、兔抗鼠Smad4多克隆抗體、兔抗鼠磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體（美國CST公司）;兔抗鼠TGF-β1Ⅱ型受體（TβR-Ⅱ）多克隆抗體、兔抗鼠Smad7多克隆抗體（美國Santa Cruz公司）;兔抗鼠Smad3多克隆抗體（美國Sigma公司）;生物素標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗（北京康為世紀(jì)生物科技有限公司）;α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4、Smad7引物均由上海生工生物工程有限公司合成;其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 細(xì)胞

大鼠肝星狀細(xì)胞CFSC-8B購于賽百慷（上海）生物技術(shù)股份有限公司。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將細(xì)胞接種于含10%小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱（下同）中培養(yǎng)24 h后，更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。取生長狀態(tài)良好并處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，加胰酶消化后，以1 000 r/min離心3 min，收集細(xì)胞并制成密度為1×105 個(gè)/mL的細(xì)胞懸液。

2.2 苦參堿對(duì)細(xì)胞增殖的影響考察

采用CCK-8法檢測。取細(xì)胞懸液，按1×104 個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（2.5 μmol/L秋水仙堿，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置濃度）和苦參堿低、中、高濃度組（30、60、120 μmol/L，根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果設(shè)置濃度），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。將以上18個(gè)孔記為試驗(yàn)孔，并另設(shè)對(duì)照孔和空白孔。培養(yǎng)24 h后，除空白對(duì)照組外，其余各組細(xì)胞均加入200 μmol/L乙醛溶液誘導(dǎo)細(xì)胞活化[10];同時(shí)，各給藥組細(xì)胞加入相應(yīng)濃度的藥液，空白對(duì)照組和模型組細(xì)胞加入等體積空白培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)基，加入CCK-8試劑（10 μL/孔），繼續(xù)培養(yǎng)2 h。采用酶標(biāo)儀于450 nm波長下測定各孔吸光度（A），根據(jù)公式計(jì)算細(xì)胞增殖率：細(xì)胞增殖率（%）=（A試驗(yàn)-A空白）/（A對(duì)照-A空白）×100%。式中，A試驗(yàn)為試驗(yàn)孔吸光度值，A對(duì)照為對(duì)照孔吸光度值（不含藥物），A空白為空白孔吸光度值（不含細(xì)胞和藥物）。試驗(yàn)重復(fù)10次。

2.3 苦參堿對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp含量的影響考察

采用酶消化法檢測。取細(xì)胞懸液，按1×104 個(gè)/孔的密度接種于96孔板中。將細(xì)胞分為空白對(duì)照組、模型組、陽性對(duì)照組（2.5 μmol/L秋水仙堿）和苦參堿中、高濃度組（60、120 μmol/L），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞活化、給藥和培養(yǎng)后，吸取上清液，以3 000 r/min離心10 min，取上清，按照Hyp試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp的含量。試驗(yàn)重復(fù)10次。

2.4 苦參堿對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)液中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ含量的影響考察

采用ELISA法檢測。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞活化、給藥和培養(yǎng)后，吸取上清液，以3 000 r/min離心10 min，取上清，按照Col-Ⅰ和COL-Ⅲ ELISA檢測試劑盒說明書操作，檢測細(xì)胞培養(yǎng)液中Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.5 苦參堿對(duì)細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4和Smad7 mRNA表達(dá)的影響考察

采用RT-PCR法檢測。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞活化、給藥和培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，收集細(xì)胞，按RNA提取試劑盒說明書操作，提取細(xì)胞中總RNA。驗(yàn)證提取RNA的純度和濃度后，取1 μg總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系：cDNA模板2? ?μL，dNTP溶液1.6 μL，BeyoTaq Buffer 2 μL，BeyoTaq DNA Polymerase 0.1 μL，上、下游引物各0.8 μL，雙蒸水12.7 μL，總體積為20 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性4 min;95 ℃變性20 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個(gè)循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 mRNA的表達(dá)水平（ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)）。試驗(yàn)重復(fù)6次。引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物片段長度見表1。

2.6 苦參堿對(duì)細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3和Smad4蛋白表達(dá)的影響考察

采用Western blotting法檢測。按“2.3”項(xiàng)下方法分組，每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，按“2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行細(xì)胞活化、給藥和培養(yǎng)后，吸棄培養(yǎng)基，參照文獻(xiàn)[11]的方法，收集細(xì)胞，按照細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白抽提試劑盒說明書操作步驟，分別提取細(xì)胞漿蛋白和細(xì)胞核蛋白，將兩者合并，以二喹啉甲酸（BCA）法測定總蛋白含量。將合并的總蛋白經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后，按1 ∶ 1 000的稀釋度加入TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad4、Smad7和GAPGH一抗，于37 ℃條件下孵育4 h;TBST 緩沖液洗膜3次，按1 ∶ 1 000的稀釋度加入IgG二抗，于37 ℃條件下繼續(xù)孵育2 h。采用ECL檢測試劑顯影，以一體式微型化學(xué)發(fā)光成像儀掃描、分析各蛋白質(zhì)條帶的灰度值，以目標(biāo)蛋白條帶與內(nèi)參GAPGH條帶的灰度值的比值表示目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平。試驗(yàn)重復(fù)6次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 細(xì)胞存活率測定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞的存活率顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，陽性對(duì)照組和苦參堿中、高濃度組細(xì)胞存活率顯著降低（P<0.05），且苦參堿的作用具有量效關(guān)系（P<0.05）。這提示中、高濃度苦參堿可以有效抑制活化細(xì)胞的異常增殖，故后續(xù)試驗(yàn)選擇這2個(gè)濃度進(jìn)行研究。各組細(xì)胞存活率測定結(jié)果見圖1。

3.2 細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量測定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量顯著升高（P<0.05）;與模型組比較，陽性對(duì)照組和苦參堿中、高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量均顯著降低（P<0.05）;與苦參堿中濃度組比較，苦參堿高濃度組細(xì)胞培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量均顯著降低（P<0.05）。各組細(xì)胞中培養(yǎng)液中Hyp、Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的含量測定結(jié)果見表2。

3.3 細(xì)胞中TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、α-SMA、Smad3、Smad4和Smad7的mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Smad7 mRNA表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，陽性對(duì)照藥組和苦參堿高濃度組細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)水平以及苦參堿中濃度組細(xì)胞中α-SMA、Smad4 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），各給藥組細(xì)胞中Smad7 mRNA表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）;與苦參堿中濃度組比較，苦參堿高濃度組細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Smad7 mRNA表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、? ? TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4、Smad7 mRNA表達(dá)水平測定結(jié)果見表3。

3.4 細(xì)胞中α-SMA、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 和Smad7的蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果

與空白對(duì)照組比較，模型組細(xì)胞中α-SMA 、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05），Smad7蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）;與模型組比較，陽性對(duì)照組和苦參堿高濃度組細(xì)胞中α-SMA 、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)水平以及苦參堿中濃度組細(xì)胞中α-SMA 、Smad4的蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），陽性對(duì)照藥組和苦參堿中、高濃度組細(xì)胞中Smad7蛋白表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與苦參堿中濃度組比較，苦參堿高濃度組細(xì)胞中α-SMA 、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4蛋白表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），Smad7蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。各組細(xì)胞中α-SMA 、TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4和Smad7蛋白表達(dá)的電泳圖見圖2，蛋白表達(dá)水平測定結(jié)果見表4。

4 討論

乙醛是酒精在體內(nèi)氧化、代謝、分解和排出體外過程中的一個(gè)中間產(chǎn)物[12]。張志畢等[13]研究發(fā)現(xiàn)，人體大量、持續(xù)地?cái)z入含酒精的飲品，便會(huì)造成乙醛在體內(nèi)不能及時(shí)代謝、分解和排出，從而導(dǎo)致肝內(nèi)分泌系統(tǒng)功能的紊亂、膠原蛋白的加速生成，進(jìn)而引發(fā)酒精性肝纖維化、肝硬化甚至是肝癌，可見抑制乙醛對(duì)肝細(xì)胞的影響是預(yù)防酒精性肝纖維化發(fā)生的一個(gè)重要靶點(diǎn)。Moshage H等[14]的研究也進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。因此，本研究利用乙醛誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化，模擬酒精性肝損傷引發(fā)的肝纖維化，以觀察苦參堿對(duì)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。肝星狀細(xì)胞被激活后會(huì)合成α-SMA，產(chǎn)生大量以Col-Ⅰ、Col-Ⅲ為主的ECM成分，而Hyp是膠原組織代謝的重要產(chǎn)物。檢測α-SMA、Col-Ⅰ、Col-Ⅲ和Hyp的含量變化，對(duì)于判斷肝星狀細(xì)胞增殖、膠原蛋白合成及肝臟纖維化的程度具有重要意義[15]。本研究結(jié)果顯示，乙醛能夠促進(jìn)肝星狀細(xì)胞的增殖，提高細(xì)胞中Hyp的含量和上調(diào)α-SMA mRNA及其蛋白的表達(dá)，加速Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的生成，這說明模型組肝星狀細(xì)胞被成功活化。與模型組比較，中、高濃度苦參堿能夠抑制活化細(xì)胞的增殖，降低細(xì)胞中Col-Ⅰ、Col-Ⅲ、Hyp含量，下調(diào)細(xì)胞中α-SMA mRNA及其蛋白表達(dá)，這說明苦參堿能夠抑制大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原合成。

TGF-β1是一種重要的多功能調(diào)節(jié)蛋白，是TGF-β超家族的重要成員，能夠誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化和增殖，生成前膠原mRNA，從而促進(jìn)膠原蛋白的合成和過度蓄積，是目前最強(qiáng)的致纖維化因子之一[16]。TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ是TGF-β1受體的亞型，是同屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體家族的高親和力結(jié)合蛋白，TβR-Ⅱ與TGF-β1結(jié)合形成具有磷酸化功能的異聚體復(fù)合物，然后通過磷酸化? ? TβR-Ⅰ的GS區(qū)，使絲氨酸/蘇氨酸殘基立體構(gòu)像改變，從而具有激酶活性，特異性識(shí)別并激活Smad2/3，活化下游Smad蛋白[17]。Smads蛋白是TGF-β受體的胞內(nèi)激酶底物[18]，包括通用型Smad4、受體激活型Smad2/3及抑制型Smad7。在TGF-β介導(dǎo)的Smad信號(hào)通路中，激活的Smad2/3與受體解離并與細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Smad4結(jié)合，傳導(dǎo)至胞核內(nèi)，與特定DNA序列結(jié)合，促進(jìn)ECM的生成和過度沉積;Smad7可抑制Smad2/3表達(dá)，競爭性地與Smad4結(jié)合，抑制ECM的生成與蓄積[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，高濃度苦參堿可顯著下調(diào)乙醛活化的肝星狀細(xì)胞中TGF-β1、TβR-Ⅰ、TβR-Ⅱ、Smad3、Smad4 mRNA及其蛋白表達(dá)，并上調(diào)Smad7 mRNA及其蛋白表達(dá)，這提示苦參堿可通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad信號(hào)通路抑制肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原合成。

綜上所述，苦參堿對(duì)大鼠肝星狀細(xì)胞的增殖和膠原合成具有抑制作用，其機(jī)制可能與調(diào)控TGF-β1/Smad信號(hào)通路傳導(dǎo)有關(guān)。然而苦參堿抑制肝星狀細(xì)胞活化增殖的作用機(jī)制復(fù)雜，具體機(jī)制還需后續(xù)進(jìn)一步深入研究證實(shí)。

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（收稿日期：2020-03-09 修回日期：2020-04-14）

（編輯：林 靜）