FAM83A對(duì)肺癌診斷的臨床意義及其對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和遷移的影響*

黃 雯,仰麗麗,吳付兵

(1.南京醫(yī)科大學(xué)第四附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000；2.南京市第二醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000；3.南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院腫瘤科，江蘇南京 210000)

肺癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率均逐年上升，每年至少有160萬(wàn)的新增病例被確診為肺癌，嚴(yán)重威脅著人類的健康[1-2]。近年來(lái)，雖然大多數(shù)癌癥的生存率穩(wěn)步上升，但肺癌的生存率進(jìn)展緩慢，由于其發(fā)病過(guò)程隱匿，多數(shù)患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生局部浸潤(rùn)或轉(zhuǎn)移，而發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者5年生存率僅為5.0%[3-5]。因此，了解肺癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制，探索新的診斷或治療靶點(diǎn)成為肺癌領(lǐng)域研究的熱門課題。序列相似性為83的家族A成員(FAM83A)，又稱為BJ-TSA-9，位于染色體8q24上[6]。最近一些研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AM83A在肺癌[7-8]、乳腺癌[9]和胰腺癌[10]中異常高表達(dá)，很有可能成為這些腫瘤診斷或治療的潛在生物標(biāo)志物。但FAM83A在肺癌中的臨床意義，以及在肺癌細(xì)胞中的生物學(xué)作用仍不清楚。本研究旨在探討肺癌患者血清中FAM83A mRNA的表達(dá)水平及臨床意義，進(jìn)一步分析干擾FAM83A表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲能力的影響，為肺癌的診斷提供新的標(biāo)志物，也為肺癌的靶向治療提供潛在的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2017年8月至2019年8月在南京醫(yī)科大學(xué)附屬逸夫醫(yī)院醫(yī)院確診為原發(fā)性肺癌的患者102例為研究對(duì)象，其中男58例，女44例，在入組前患者均未接受放療、化療等治療?；颊叩脑\斷和臨床病理特征包括腫瘤大小、TNM分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均經(jīng)過(guò)兩位以上病理學(xué)醫(yī)生確認(rèn)。選取同期在醫(yī)院進(jìn)行體檢的健康人員98例作為對(duì)照組，其中男45例，女53例。所有入組人員均簽署知情同意書(shū)。所有參與者抽取靜脈血5 mL用于分離血清檢測(cè)FAM83A。

1.2儀器與試劑 MTT檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和定量PCR試劑盒購(gòu)自Takara公司；Transwell小室和Matrigel膠購(gòu)自美國(guó)BD公司；FAM83A和GAPDH單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；ABI PRISM 7500定量PCR儀購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.3方法

1.3.1生物信息學(xué)分析FAM83A在肺癌組織中的表達(dá) 利用生物信息學(xué)在線工具“GEPIA” (http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析FAM83A在肺癌組織和正常組織中的表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 培養(yǎng)肺癌細(xì)胞A549和SK-MES-1，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染si-FAM83A。在轉(zhuǎn)染中設(shè)置siRNA-NC(si-NC)對(duì)照組，si-FAM83A-1組，si-FAM83A-2組，熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)確定轉(zhuǎn)染效率。siRNA序列如下，si-FAM83A-1:5′-GCA CAA CAA CAT CAG AGA CCT-3′；si-FAM83A-2:5′-GAC TGG AGA TTT GTC CTG TCT-3′；si-NC:5′-UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-3′。

1.3.3qRT-PCR檢測(cè)FAM83A mRNA的表達(dá) Trizol試劑提取各組細(xì)胞標(biāo)本中的總RNA。將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA并進(jìn)行qRT-PCR檢測(cè)。擴(kuò)增引物序列如下：FAM83A上游引物為5′-CCC ATC TCA GTC ACT GGC ATT-3′，下游引物為5′-CCG CCA ACA TCT CCT TGT TC-3′；GAPDH上游引物為5′-AAT GAA GGG GTC ATT GAT GG-3′，下游引物為5′-AAG GTG AAG GTC GGA GTC AA-3′。以GAPDH作為內(nèi)參，結(jié)果以2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量表示。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.4Western blot檢測(cè)FAM83A蛋白的表達(dá) 提取各組細(xì)胞中的總蛋白，BCA法定量蛋白濃度，然后對(duì)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳、轉(zhuǎn)模、封閉，隨后加入一抗(FAM83A按1∶1 000稀釋，或GAPDH按1∶3 000稀釋)4 ℃反應(yīng)過(guò)夜。TBST漂洗膜3次后加入HRP標(biāo)記二抗，室溫條件下反應(yīng)2 h。然后TBST漂洗膜3次，最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒進(jìn)行蛋白顯影，化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)成像檢測(cè)蛋白質(zhì)印跡條帶。

1.3.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將轉(zhuǎn)染si-FAM83A或si-NC的肺癌細(xì)胞A549和SK-MES-1細(xì)胞接種至96孔板中，隨后按MTT檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)培養(yǎng)0、24、48、72 h后細(xì)胞在570 nm波長(zhǎng)下的吸光度，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.3.6Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移侵襲 轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)：將Transwell小室放置于24孔板內(nèi)，將轉(zhuǎn)染si-FAM83A或si-NC的肺癌細(xì)胞A549或SK-MES-1細(xì)胞接種于上室。培養(yǎng)48 h后用4.0%多聚甲醛溶液對(duì)小室膜下面的細(xì)胞進(jìn)行固定，然后用0.1%結(jié)晶紫染色。各組隨機(jī)選取6個(gè)視野顯微鏡下觀察拍照并計(jì)數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)：取100 μL Matrigel膠包被Transwell小室底部膜的上室，其余同轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1生物信息學(xué)分析FAM83A在肺癌組織中的表達(dá) 生物信息學(xué)“GEPIA”分析結(jié)果顯示，與正常組織相比，肺癌組織中的FAM83A相對(duì)表達(dá)水平明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

注：與肺癌組織比較，*P<0.05。

圖1 “GEPIA”分析FAM83A在肺癌組織和正常肺組織中的相對(duì)表達(dá)水平

2.2肺癌患者血清中FAM83A mRNA的表達(dá) qRT-PCR結(jié)果顯示，肺癌患者血清中FAM83A mRNA相對(duì)表達(dá)水平明顯高于體檢健康者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見(jiàn)圖2。

2.3血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平在肺癌患者中的診斷作用 以血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平參數(shù)模型作為檢驗(yàn)指標(biāo)，繪制診斷肺癌的ROC曲線。FAM83A mRNA表達(dá)水平的ROC曲線下的面積分別為0.927(95.0%CI：0.892～0.962)。其中FAM83A mRNA表達(dá)水平診斷肺癌的截?cái)嘀禐?.12時(shí)，靈敏度為82.0%，特異度為90.0%。見(jiàn)圖3。

2.4肺癌患者血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平與化學(xué)、臨床病理特征之間的關(guān)系 肺癌患者血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平與年齡之間無(wú)明顯相關(guān)性，但與腫瘤大小、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈顯著相關(guān)(P<0.001)。見(jiàn)圖4。

注：與肺癌患者比較，**P<0.01。

圖2 qRT-PCR檢測(cè)肺癌患者和體檢健康者血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平

圖3 血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平診斷肺癌的ROC曲線

圖4 患者血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平與臨床病理特征之間的關(guān)系

2.5轉(zhuǎn)染si-FAM83A對(duì)肺癌細(xì)胞FAM83A mRNA和蛋白表達(dá)的影響 將si-FAM83A或si-NC轉(zhuǎn)染A549和SK-MES-1細(xì)胞24 h后，qRT-PCR結(jié)果顯示，與si-NC組相比，si-FAM83A組的A549和SK-MES-1細(xì)胞中FAM83A mRNA相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且si-FAM83A-1在A549和SK-MES-1細(xì)胞中干擾FAM83A mRNA表達(dá)效率高于si-FAM83A-2。Western blot結(jié)果顯示與si-NC組相比，si-FAM83A組的A549和SK-MES-1細(xì)胞中FAM83A蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著降低，且si-FAM83A-1在A549和SK-MES-1細(xì)胞中干擾FAM83A蛋白表達(dá)效率高于si-FAM83A-2。因此，選用si-FAM83A-1(si-FAM83A)轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

注：A和B分別表示Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FAM83A表達(dá)對(duì)A549和SK-MES-1細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。***P<0.001。

圖5 干擾FAM83A表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移

注：A和B分別表示Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)干擾FAM83A表達(dá)對(duì)A549和SK-MES-1細(xì)胞侵襲的影響。***P<0.001。

圖6 干擾FAM83A表達(dá)抑制肺癌細(xì)胞侵襲

2.6干擾FAM83A表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞增殖的影響 MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h這3個(gè)時(shí)間點(diǎn)時(shí)，與si-NC組相比，轉(zhuǎn)染si-FAM83A組細(xì)胞的吸光度值隨時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸下降，且幅度逐漸增大，其中培養(yǎng)72 h后表現(xiàn)最顯著。在培養(yǎng)72 h后的A549細(xì)胞中，與si-NC組細(xì)胞的吸光度值(1.307±0.030)相比，si-FAM83A組細(xì)胞的吸光度值(0.939±0.030)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，在培養(yǎng)72 h后的SK-MES-1細(xì)胞中，與si-NC組細(xì)胞的吸光度值(1.527±0.032)相比，si-FAM83A組細(xì)胞的吸光度值(1.234±0.030)明顯下降，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.7干擾FAM83A表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響 Transwell轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A549細(xì)胞中，與si-NC組視野平均轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)(112.000±9.160)相比，si-FAM83A組視野平均轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)(34.000±3.300)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖5。在SK-MES-1細(xì)胞中，與si-NC組視野平均轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)(138.000±10.410)相比，si-FAM83A組視野平均轉(zhuǎn)移細(xì)胞數(shù)(68.500±4.300)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。

2.8干擾FAM83A表達(dá)對(duì)肺癌細(xì)胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在A549細(xì)胞中，與si-NC組視野平均侵襲細(xì)胞數(shù)(75.300±4.500)相比，si-FAM83A組視野平均侵襲細(xì)胞數(shù)(36.830±2.710)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖6A。在SK-MES-1細(xì)胞中，與si-NC組視野平均侵襲細(xì)胞數(shù)(115.180±9.500)相比，si-FAM83A組視野平均侵襲細(xì)胞數(shù)(58.560±4.310)顯著減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)，見(jiàn)圖6B。

3 討 論

肺癌，連同肝癌和結(jié)直腸癌是全世界癌癥死亡的三大主要原因，近年來(lái)其發(fā)病率呈上升和年輕化趨勢(shì)，肺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移是一個(gè)復(fù)雜的多基因參與的調(diào)控過(guò)程[11-13]。因此，研究肺癌增殖、轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)肺癌的診斷和治療具有重要的臨床意義。

在乳腺癌中FAM83A的表達(dá)明顯升高，與乳腺癌的預(yù)后顯著相關(guān)[14]。在胰腺癌中FAM83A顯著過(guò)表達(dá)，并與胰腺癌患者的癌癥干細(xì)胞數(shù)目及整體生存率呈顯著相關(guān)性[10]。還有研究表明FAM83A在肺腺癌和非小細(xì)胞肺癌組織中高表達(dá)，且和預(yù)后明顯相關(guān)[7,15]。以上研究表明FAM83A在腫瘤中高表達(dá)，且與患者的預(yù)后不良密切相關(guān)。本研究通過(guò)“GEPIA”分析發(fā)現(xiàn)FAM83A在肺癌組織中顯著高表達(dá)，進(jìn)一步在肺癌患者血清中發(fā)現(xiàn)FAM83A mRNA顯著高表達(dá)，且與患者腫瘤大小、TNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈明顯相關(guān)性，提示血清FAM83A的高表達(dá)與肺癌發(fā)展密切相關(guān)，提示血清FAM83A可能和肺癌患者的預(yù)后不良也相關(guān)，該結(jié)果和以往的研究結(jié)果類似[7,15]。以血清中FAM83A mRNA表達(dá)水平進(jìn)行肺癌診斷時(shí)ROC曲線下面積為0.927，最佳截?cái)嘀禐?.120，具有較高的靈敏度和特異度。以上研究結(jié)果表明血清中FAM83A表達(dá)能夠作為肺癌的診斷標(biāo)志物，并和肺癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。

現(xiàn)有研究雖然都有報(bào)道FAM83A的表達(dá)，但FAM83A在肺癌中具體發(fā)揮著什么作用仍有許多未知。干擾FAM83A能夠顯著抑制HER2+乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)其凋亡[16]。還有研究表明在體外和體內(nèi)干擾FAM83A能顯著降低乳腺癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[9]。本研究發(fā)現(xiàn)干擾FAM83A表達(dá)可對(duì)A549和SK-MES-1細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲產(chǎn)生明顯的抑制作用，表明干擾FAM83A能夠抑制肺癌的發(fā)生發(fā)展。SHI等[17]報(bào)道發(fā)現(xiàn)LncRNA FAM83A-As能顯著提高FAM38A蛋白水平，誘導(dǎo)ERK磷酸化，從而促進(jìn)肺癌細(xì)胞增殖和侵襲。本研究結(jié)果與SHI等[17]發(fā)現(xiàn)相似，表明FAM83A在肺癌中發(fā)揮癌基因的作用，提示FAM83A可能成為肺癌治療的潛在靶點(diǎn)。本研究證實(shí)FAM83A對(duì)肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲起著至關(guān)重要的作用，但至于FAM83A影響腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移特性的具體作用機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。后續(xù)將繼續(xù)在動(dòng)物體內(nèi)探討FAM83A對(duì)腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移能力的影響。

4 結(jié) 論

血清中FAM83A mRNA能夠作為肺癌的診斷標(biāo)志物，同時(shí)，干擾FAM83A表達(dá)能夠抑制肺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力，可為肺癌的預(yù)防和治療提供潛在的靶點(diǎn)。