柯薩奇病毒A組6型TaqMan一步法實時熒光定量PCR方法的建立*

劉紅波，叢山日，許丹菡，黃小琴，孫 浩，楊昭慶，馬紹輝△

(1.中國醫(yī)學科學院&北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)學生物學研究所，云南昆明 650118;2.云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，云南昆明 650118)

自1998年以來，手足口病(HFMD)已成為全球重要的公共衛(wèi)生問題[1]。與HFMD相關(guān)的病原體較為復雜，其中，以腸道病毒71型(EV-A71)和柯薩奇病毒A組16型(CV-A16)為主[2]。然而，從2008年起，與柯薩奇病毒A組6型(CV-A6)相關(guān)的HFMD病例在多個國家及我國許多地區(qū)被報道。并且，CV-A6病毒感染引起的HFMD具有非典型臨床癥狀，主要表現(xiàn)為非典型皰疹、甲狀腺腫、脫甲等，嚴重危害公眾健康[3-7]。因此，CV-A6病毒得到了我國疾病預防控制部門和醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)的充分重視，被納入日常監(jiān)測和臨床檢驗中。傳統(tǒng)檢測病毒的方法有病毒分離、生化、血清學診斷等，這些方法雖然可靠，但檢測周期長，操作復雜，不易快速得出結(jié)論。近年來發(fā)展起來的熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)，因其靈敏度、特異度、重復性好且操作簡便快速，被廣泛應用于病原體的定性定量檢測[8]。

1 材料與方法

1.1標本 CV-A6(KYN-A1205、YN-A13)、EV-A71、CV-A16和CV-A10毒株由本實驗室保存并提供，SPF級別實驗動物BALB/c孕鼠由本單位的小動物實驗部提供，實驗動物操作經(jīng)中國醫(yī)學科學院醫(yī)學生物學研究所動物倫理委員會批準(批準編號：DWSP201804001)。

1.2儀器與試劑 熒光定量PCR儀CFX96(BIORAD，美國)、病毒RNA提取試劑盒(Axygen Body Fluid viral DNA/RNA Miniprep Kit，美國)、病毒RNA擴增試劑盒(PrimescriptTMOne Step RT PCR Kit Ver.2)、瓊脂糖凝膠回收DNA試劑盒(E.Z.N.A.TMGel Extraction Kit，美國)、加尾試劑盒(DNA A-Tailing Kit)、T載體(pMDTM18-T Vector Cloning Kit)、質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(thermo scientificTM/GeneJET Plasmid Miniprep)、體外轉(zhuǎn)錄試劑盒(In vitro Transcription T7 Kit，for siRNA Synthesis)、核酸稀釋液(EASY Dilution，for Real Time PCR) 、一步法實時熒光定量PCR試劑盒(One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit，for Perfect Real Time)等。

1.3引物和探針設(shè)計 從GenBank數(shù)據(jù)庫中下載15條CV-A6 VP1基因序列，利用MEGA7.0軟件比對后找出保守區(qū)域設(shè)計特異性引物(CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R)和Taqman探針(CV-A6-probe)，利用NCBI數(shù)據(jù)庫中Primer-BLAST檢測引物和探針的特異性。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，探針5′標記的熒光報告基團為FAM，3′標記的熒光淬滅基團為BHQ。

1.4陽性RNA標準品的建立 以本實驗室分離并鑒定為CV-A6的毒株KYN-A1205(基因登錄號：MN184853)作為模板，設(shè)計擴增引物CV-A6-VP1-F和CV-A6-VP1-R，其中上游引物包含T7啟動子，且該對引物包含CV-A6-qP-F、CV-A6-qP-R引物及CV-A6-probe。采用病毒RNA擴增試劑盒進行RT-PCR反應，陽性PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠試劑盒回收后利用DNA加尾試劑盒對其3′末端加“A尾”；與pMD18-T Vector連接并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細胞，菌落PCR確定陽性克??；利用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，送往碩擎(昆明)生物技術(shù)有限公司并用pMD18-T Vector通用引物M13F和M13R測序確定目的片段插入的方向；Sal I限制性內(nèi)切酶將重組質(zhì)粒線性化后切膠回收；體外轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄出目的RNA，并用紫外分光光度計測定其水平；根據(jù)公式計算拷貝數(shù)：單位體積RNA拷貝數(shù)(copy/mL)=6.02×1023×(X g/mL)/(RNA堿基數(shù)×340)，RNA于-20 ℃保存?zhèn)溆?。其中，本實驗所用到的引物和探針序列見?。

表1 引物和探針序列

注：下劃線序列為T7啟動子序列。

1.5RT-qPCR方法的建立 反應體系(20 μL)： 2×One Step RT-PCR Buffer Ⅲ緩沖液10 μL，TaKaRa Ex Taq HS(5 U/μL)為0.4 μL，PrimeScript RT Enzyme MixⅡ為0.4 μL，CV-A6-Probe(10 μmol/L)為0.8 μL，CV-A6-qP-F(10 μmol/L)為0.4 μL，CV-A6-qP-R(10 μmol/L)為0.4 μL,RNA模板為1 μL，RNase Free H2O為6.6 μL，其中引物和探針水平為試劑盒推薦的最佳濃度。按照說明書設(shè)置反應條件：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s，另95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s共40 個循環(huán)。

1.6靈敏度試驗 根據(jù)上述RNA拷貝數(shù)計算公式，用核酸稀釋液EASY Dilution(for Real Time PCR)將RNA標準品稀釋至初始濃度834 ng/μL(對應拷貝數(shù)為1012copy/μL)，連續(xù)10倍梯度稀釋，從1011～100copy/μL，并設(shè)置無模板對照(NTC)，按照上述反應體系及反應條件進行一步法RT-qPCR，從而確定檢測最低拷貝數(shù)的極限。為了評估該標準品的重復性和穩(wěn)定性，每個稀釋度設(shè)置3個復孔。選取上述9個稀釋度(103～1011copy/μL)對應拷貝數(shù)的對數(shù)和循環(huán)閾值Ct值，系統(tǒng)自動生成標準曲線。

1.7特異度試驗 對EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10核酸進行檢測以評估該方法的特異度。

1.8乳鼠組織病毒載量檢測 毒株YN-A13感染1日齡BALB/c乳鼠后解剖取心、肝、脾、肺、腎、腸、腦組織并提取RNA，按照上述反應體系及反應條件進行一步法RT-qPCR，反應結(jié)束后根據(jù)Ct值和標準曲線公式計算出各組織中的病毒載量。

2 結(jié) 果

2.1陽性RNA標準品的建立 經(jīng)RNA拷貝數(shù)公式計算得出，當RNA標準品稀釋至初始濃度為834 ng/μL 時，其對應拷貝數(shù)為1012copy/μL(RNA標準品長度為1 477 nt)。

2.2實驗的靈敏度 經(jīng)檢測，RNA標準品在102～1011copy/μL范圍內(nèi)出現(xiàn)良好的擴增曲線,見圖1A。當模板為102copy/μL時，Ct值為35.8，從而認為該方法的檢測極限約為102copy/μL。RNA標準品在103～1011copy/μL的范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，見圖1B(R2系數(shù)為0.999，擴增效率為109.6%，方程式為Y=-3.112X+43.149)。

注：A、B、C、D、E、F、G、H、I、J分別代表1011、1010、109、108、107、106、105、104、103、102copy/μL RNA樣品;A為擴增曲線;B為標準曲線。

圖1 不同稀釋度的擴增曲線

2.3重復性試驗 在本研究中，對102～1011copy/μL范圍內(nèi)的9個稀釋度的樣品各進行3次組內(nèi)重復性試驗，并對試驗結(jié)果進行統(tǒng)計分析。利用軟件SPSS19.0計算出組內(nèi)熒光定量中Ct值及R2的值的變異系數(shù)(CV)，見表2。

表2 RT-qPCR 組內(nèi)重復性試驗

2.4特異度試驗 利用該方法檢測EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10病毒核酸時，僅有CV-A6出現(xiàn)陽性擴增曲線，其余病毒及NTC檢測結(jié)果均為陰性，見圖2。

圖2 RT-qPCR的特異度試驗

2.5乳鼠組織病毒載量檢測結(jié)果 用該方法檢測YN-A13毒株感染1日齡BALB/c乳鼠后各組織中CV-A6的載量。其中，各樣本均出現(xiàn)良好的擴增曲線見圖3A。Ct值在18.98～34.46，根據(jù)各樣本達到熒光閾值對應的Ct 值和標準曲線的公式可精確計算出各組織中CV-A6病毒的載量，見圖3B。

注：A為乳鼠各組織及標準品各稀釋度擴增曲線;B為乳鼠各組織病毒載量。

圖3 乳鼠組織病毒載量檢測結(jié)果

3 討 論

CV-A6為單股正鏈的小RNA病毒，作為近十年來引起HFMD的主要病原體之一，嚴重危害兒童的健康[9]。CV-A6感染可引起全身性水皰疹、侵蝕性皮疹和紫癜損傷等非典型HFMD臨床癥狀，部分CV-A6感染可導致無菌性腦膜炎和腦干腦炎等嚴重疾病[10-11]。而且CV-A6感染容易與其他出疹性疾病，如水痘、麻疹等混淆，致使臨床醫(yī)生發(fā)生漏診甚至誤診的情況。因此，建立一種快速準確檢測CV-A6感染的方法，為CV-A6的流行病學調(diào)查和實驗室診斷均提供了可靠的檢測技術(shù)。

傳統(tǒng)檢測CV-A6的方法以病毒分離培養(yǎng)和血清學診斷為主[12]。病毒分離作為病毒性疾病診斷的金標準，常采用細胞培養(yǎng)對臨床樣品進行病毒分離。雖然，該方法特異度強，但培養(yǎng)周期過長，分離率低，因而，常被用于回顧性診斷。血清學診斷技術(shù)也伴有周期長和靈敏度低等缺點。另外，目前實驗室常用的普通RT-PCR特異度雖強，但易污染且只能進行定性分析[13]。

CV-A6病毒與其他腸道病毒結(jié)構(gòu)類似，其中VP1基因相對保守，常被用作病毒血清型鑒定以及進化分析的靶基因。本研究選擇CV-A6的VP1基因比對后的保守區(qū)域設(shè)計引物和探針，構(gòu)建一步法RT-qPCR檢測方法，為進一步提高引物和探針與靶基因結(jié)合位點的保守性。另外，TaqMan探針與模板特異度互補，極大提高了反應的特異度。利用該方法檢測EV-A71、CV-A16、CV-A6和CV-A10病毒核酸時，僅有CV-A6核酸出現(xiàn)擴增曲線，進一步提示該方法具有較強的特異度。經(jīng)檢測，該方法在102～1011copy/μL模板范圍內(nèi)，均具有良好的擴增曲線，提示該方法在很大的線性范圍內(nèi)可對病毒核酸進行檢測和定量分析。再者，通過對該方法的重復性進行分析發(fā)現(xiàn)，組內(nèi)CV值在0.20%～1.01%，小于2.00%，說明其重復性良好[14]。利用該方法檢測感染CV-A6后BALB/c乳鼠組織的病毒載量，發(fā)現(xiàn)各樣本均出現(xiàn)良好的擴增曲線，根據(jù)Ct值和標準曲線的公式可精確計算出各組織中初始病毒量。

另外，與李洋等[15]建立的CV-A6 TaqMan探針RT-qPCR檢測方法不同的是，本研究將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒進一步線性化，并通過體外轉(zhuǎn)錄獲得RNA為標準品。在檢測反應體系中，RNA標準品與待檢測的樣品同步進行，一步法完成逆轉(zhuǎn)錄及qPCR的過程，保證了每個樣品的擴增效率一致，對病毒進行定量時也盡可能地降低了試驗誤差。并且，在1 h內(nèi)可以同步完成96孔樣品的擴增及檢測，RT-qPCR產(chǎn)物無需凝膠電泳檢測和測序分析，極大地節(jié)約了時間和成本。當然，該檢測方法也存在一些不足，例如無法檢測擴增片段的大小以及各個實驗室構(gòu)建的標準品有所不同導致實驗結(jié)果缺乏可比性，但相信隨著科技的發(fā)展，這些問題終將被突破。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了用于檢測CV-A6并能對病毒精準定量的方法，為CV-A6的流行病學調(diào)查和預防帶來了幫助。本檢測方法特異度強，靈敏度高，重復性好，能夠可靠地應用于CV-A6的檢測。