高效降解氨氮的芽孢桿菌篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化

張冠根，陳鵬程，鄭璞*，吳丹，喬慧，張文宜，蔣速飛

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)院淡水漁業(yè)研究中心，江蘇 無(wú)錫，214081)

目前對(duì)枯草芽孢桿菌高密度發(fā)酵的研究較多，產(chǎn)芽孢量也較高，可達(dá)到7×1010CFU/mL[6]。但有關(guān)解淀粉芽孢桿菌產(chǎn)芽孢發(fā)酵報(bào)道較少，REN等[7]通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基的碳源、氮源、無(wú)機(jī)鹽，產(chǎn)芽孢數(shù)可達(dá)到 8.05×109CFU/mL，為目前所報(bào)道的最高產(chǎn)芽孢量。

本文利用以(NH4)2SO4為唯一氮源的選擇性培養(yǎng)基，采用96孔板高通量篩選方法，在淤泥中篩選出1株可快速去除氨氮的解淀粉芽孢桿菌菌株?？疾炝怂拿摰再|(zhì)，并優(yōu)化發(fā)酵產(chǎn)芽孢的條件。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)樣品：江南大學(xué)池塘內(nèi)土壤(N31°28′47″，E120°15′59″)。

孔板培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3.75，(NH4)2SO40.25，K2HPO41.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，NaCl 5，pH 7。

氨氮培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3.75， (NH4)2SO40.5，K2HPO41.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，NaCl 5，pH 7。

亞硝酸氮培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖3.75，NaNO20.49，K2HPO41.0，KH2PO40.3，MgSO4·7H2O 0.05，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，NaCl 5，pH 7。

優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖12.0，蛋白胨15，酵母粉15，KH2PO40.8，MnCl20.1，NaCl 1，CaCl20.1，pH 7。

培養(yǎng)基1(g/L)：酵母粉2，大豆蛋白粉4，酵母浸膏2，糖蜜2，玉米蛋白粉1，KH2PO40.05，MgCO30.05，CaCO30.3，NaCl 0.03，pH 7.0。

培養(yǎng)基2(g/L)：葡萄糖17.51，酵母粉 9.88，CaCl22.11，pH 7。

培養(yǎng)基3(g/L)：玉米粉3，糖蜜10，豆粕粉10，魚(yú)粉10，K2HPO42，Na2HPO42，MgSO40.5，MnSO40.5，pH 7.0。

培養(yǎng)基4(g/L)：乳糖10，蛋白胨7.45，NaCl 5，MgSO4·7H2O 2.46，CaCl21.22，K2SO40.087，pH 7。

培養(yǎng)基5(g/L)：麩皮15，豆粕15，NaCl 5，CaCO30.2，MnSO4·H2O 0.2，MgSO4·7H2O 0.2，pH 7。

培養(yǎng)基6(g/L)：葡萄糖36.0，大豆蛋白胨15，酵母粉18，玉米漿12，KH2PO40.8，MnCl20.1，NaCl 1，CaCl20.1，pH 7。

1.2 實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法

1.2.1 菌株篩選

將采集的土壤按30 g/L的質(zhì)量濃度接種于(NH4)2SO4為唯一氮源的富集培養(yǎng)基[8]中，37 ℃、110 r/min進(jìn)行富集馴化培養(yǎng)2 d。培養(yǎng)結(jié)束后，將菌液稀釋至10-1～10-9，取合適濃度的稀釋液0.1 mL在富集培養(yǎng)基平板上進(jìn)行涂布，37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后用牙簽將獲得的單菌落接種于裝有1 mL孔板培養(yǎng)基的96深孔板中，30 ℃，110 r/min搖床培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)完成后將96深孔板于3 000 r/min 下離心15 min，對(duì)上清液中剩余氨氮濃度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)培養(yǎng)基中剩余氨氮濃度較低的菌株做進(jìn)一步篩選。

將初篩所得菌株接種于氨氮培養(yǎng)基，110 r/min，30 ℃培養(yǎng)24 h后作為種子液以3%的接種量分別接種于氨氮培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min進(jìn)行培養(yǎng)，每5 h取發(fā)酵液，10 000 r/min離心2 min，測(cè)定上清液中的氨氮含量，計(jì)算氨氮的去除率，保存氨氮降解率最高的菌株。

(1)

式中：C0,初始氨氮濃度;C1,剩余氨氮濃度。

1.2.2 菌株鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：觀察LB平板上的菌落形態(tài)及表面特征，進(jìn)行革蘭氏染色以及芽孢染色。

生理生化鑒定：參照文獻(xiàn)[9]。

分子鑒定：在LB培養(yǎng)基中，30 ℃、110 r/min培養(yǎng)過(guò)夜，細(xì)菌DNA試劑盒提取優(yōu)選菌株的基因組DNA。按照文獻(xiàn)[10]所述方法通過(guò)16S rDNA基因分析鑒定分離的菌株，將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA7.0軟件構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)。

1.2.3 菌株的脫氮性質(zhì)研究

1.2.3.1 氨氮以及亞硝酸鹽的去除途徑

將菌株分別接種于氨氮培養(yǎng)基、亞硝酸氮培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)24 h后作為種子液以3%的接種量分別接種于相應(yīng)培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)，每隔 4 h取樣，檢測(cè)培養(yǎng)液中氨氮、亞硝態(tài)氮、硝酸鹽濃度以及菌濃OD600。

1.2.3.2 氨氮耐受性研究

將菌株接種于氨氮培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)24 h后作為種子液以3%的接種量接種于氨氮濃度分別設(shè)置為100、200、500、800、1 000 mg/L 氨氮培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定氨氮降解率以及菌體濃度OD600。

1.2.3.3 有機(jī)氮存在下菌株對(duì)氨氮的降解情況

將菌株接種于氨氮培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)24 h后作為種子液以3%的接種量接種于胰蛋白胨質(zhì)量濃度分別設(shè)置為0、0.8、1.6、3.2、6.4 g/L的氨氮培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)24 h后測(cè)定氨氮降解率。

1.2.4 菌株的高密度產(chǎn)芽孢發(fā)酵

1.2.4.1 初始發(fā)酵培養(yǎng)基篩選

將斜面保存的菌株用接種環(huán)接入LB培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)12 h后，以5%的接種量分別接入培養(yǎng)基1～6[11-16]，37 ℃，110 r/min培養(yǎng)36 h后取樣測(cè)定菌體濃度(OD600)以及芽孢數(shù)。

1.2.4.2 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化

將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源改為蛋白胨15 g/L，酵母膏15 g/L，同時(shí)碳源改為分別添加3、6、12、24 g/L的葡萄糖，將初始發(fā)酵培養(yǎng)基中的碳氮比(質(zhì)量比)分別設(shè)置為0.33、0.67、1.32、2.64。B4斜面上挑取1環(huán)菌接入初始發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃，110 r/min培養(yǎng)12 h后，以5%的接種量分別接入不同碳氮比(質(zhì)量比)的發(fā)酵培養(yǎng)基中，37 ℃，110 r/min培養(yǎng)36 h后取樣測(cè)定菌體濃度以及芽孢數(shù)。

1.2.4.3 3 L發(fā)酵罐葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵

于斜面上挑取1環(huán)菌接入優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基，110 r/min，30 ℃培養(yǎng)12 h，按5%的接種量接入裝有優(yōu)化培養(yǎng)基的發(fā)酵罐。發(fā)酵參數(shù)：溫度37 ℃，轉(zhuǎn)速400 r/min，通氣量1.0 vvm，裝液量1.5 L。用4 mol/L NaOH維持發(fā)酵液pH 6.5～7.0。初始葡萄糖耗盡后，開(kāi)始進(jìn)行葡萄糖的補(bǔ)料，補(bǔ)料速度分別設(shè)置為10以及20 g/(L·h)，菌體濃度達(dá)到最高后停止補(bǔ)料，補(bǔ)料結(jié)束后不再調(diào)節(jié)pH，發(fā)酵過(guò)程中每2 h取樣測(cè)定菌體濃度(OD600)以及記錄pH和溶氧變化，24 h后取樣測(cè)定芽孢數(shù)。

1.2.5 所制備菌劑對(duì)模擬養(yǎng)殖水體中氨氮的降解

為模擬不同氨氮濃度養(yǎng)殖水體，取自來(lái)水分別加入不同量的NH4Cl，使氨氮質(zhì)量濃度分別為1、10、20、50 mg/L，另外對(duì)應(yīng)加入葡萄糖使水中m(碳)∶m(氮)=10∶1。取所制備的B4菌劑，分別投入裝有30 mL配制好的不同氨氮質(zhì)量濃度為1、10、20、50 mg/L水體的250 mL搖瓶中，使菌株B4終濃度均為105CFU/mL，30 ℃，110 r/min搖瓶培養(yǎng)48 h，每12 h取樣測(cè)定氨氮質(zhì)量濃度。

1.2.6 檢測(cè)方法

氨氮濃度的測(cè)定采用靛酚藍(lán)比色法[17]；亞硝態(tài)氮的濃度測(cè)定采用N-乙二胺分光光度法[18]；硝酸氮測(cè)定采用紫外分光光度法(HJ/T 346—2007)；芽孢計(jì)數(shù)方法為：將發(fā)酵液置于80 ℃水浴10 min以殺死不能形成芽孢的活菌后，采用平板涂布法(GB 20287—2006)進(jìn)行芽孢計(jì)數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

2.1.1 菌株的高通量初篩

氨與苯酚和次氯酸鈉在酸性條件下，經(jīng)亞硝基鐵氰化鈉催化生成藍(lán)色的靛酚，利用這一原理建立了96孔板高通量篩選的方法。樣品經(jīng)富集、分離、純化得到428顆單菌落，經(jīng)過(guò)48 h培養(yǎng)，其中6株菌可將孔板培養(yǎng)基中的50 mg/L的氨氮完全去除，分別命名為B1、B2、B3、B4、B5、B6。

2.1.2 菌株的搖瓶復(fù)篩

對(duì)初篩所獲得的菌株每隔5 h進(jìn)行氨氮?dú)堄嗔康臏y(cè)定(表1)。6株菌中B4在15 h時(shí)就幾乎完成了氨氮的去除，氨氮去除速度為5.93 mg/(L·h)，高于一些假交替單胞菌Pseudoalteromonassp.2906[<1 mg/(L·h)][19]以及好氧反硝化菌Rhodococcussp. CPZ24[2.5 mg/(L·h)][20]，最終氨氮去除率為92.32%，展示出了較高效的氨氮去除能力，因此選擇B4菌株作進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

表1 六株菌的氨氮去除率Table 1 Ammonia degradation rate of six strains

注: 同列數(shù)據(jù)肩標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)

2.1.3 菌株的鑒定

菌落在LB平板生長(zhǎng)初期為乳白色，后變?yōu)辄S色，不透明，表面暗且較粗糙，邊緣不規(guī)則呈樹(shù)枝狀像四周伸展，菌落中心黏液呈圈狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，有芽孢。硝酸鹽反應(yīng)、淀粉水解、V-P反應(yīng)、丙二酸利用、檸檬酸鹽利用、接觸酶反應(yīng)、D-果糖產(chǎn)酸、明膠液化、厭氧生長(zhǎng)均為陽(yáng)性；卵磷脂酶反應(yīng)、吲哚實(shí)驗(yàn)、苯丙氨酸脫氫酶實(shí)驗(yàn)均為陰性。將B4的16S rDNA測(cè)序結(jié)果在NCBI網(wǎng)站進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA7.0軟件以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)[21]，并結(jié)合其生理生化實(shí)驗(yàn)，鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖1 基于菌株B4的16srDNA構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree based on 16S rDNA of strain B4

2.2 菌株的脫氮特性研究

2.2.1 菌株對(duì)氨氮與亞硝酸鹽的去除特性

菌株B4對(duì)氨氮的降解過(guò)程中，氨氮濃度伴隨菌體濃度的增加逐漸減少，表明菌株的生長(zhǎng)與氨氮去除同步(圖2-a)。20 h以后，菌液濃度呈下降趨勢(shì)，氨氮濃度不再下降，并且整個(gè)生長(zhǎng)過(guò)程中并無(wú)亞硝酸鹽或硝酸鹽產(chǎn)生，說(shuō)明菌株并不進(jìn)行硝化作用而是通過(guò)銨鹽同化以合成細(xì)胞物質(zhì)。

亞硝酸氮與氨氮去除過(guò)程略有差別(圖2-b)，在亞硝酸氮為氮源的培養(yǎng)基中，菌株B4的生長(zhǎng)延滯期更長(zhǎng)，相同的是，亞硝酸氮濃度也是在菌株的指數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)快速降低，經(jīng)過(guò)20 h培養(yǎng)，培養(yǎng)基中50 mg/L的亞硝酸氮被完全去除。同時(shí)在B4生長(zhǎng)過(guò)程中未檢測(cè)到氨氮的存在，這說(shuō)明B4通過(guò)硝酸鹽同化作用吸收亞硝酸氮。

a-菌株的生長(zhǎng)與氨氮去除關(guān)系；b-菌株生長(zhǎng)與亞硝酸鹽去除關(guān)系圖2 B4對(duì)氨氮和亞硝酸鹽的去除特性Fig.2 Degradation and growth of ammonia and nitrite by strain B4

2.2.2 氨氮耐受性研究

相比于氨氮質(zhì)量濃度為100 mg/L，氨氮質(zhì)量濃度增加至200、500、800、1 000 mg/L時(shí)，氨氮去除率有所下降,分別為49.91%、21.90%、20.06%、27.41%(圖3)，不過(guò)氨氮濃度增加后，B4可正常生長(zhǎng)，菌體濃度有所提高，并且24 h內(nèi)去除了更多的氨氮，有更快的氨氮降解速度。不同氨氮濃度下的菌體生長(zhǎng)以及氨氮去除速率表明B4可適應(yīng)高濃度氨氮的環(huán)境，具有處理高濃度氨氮工業(yè)廢水的潛在應(yīng)用價(jià)值。

圖3 B4對(duì)不同濃度氨氮耐受性Fig.3 B4 tolerance to different concentrations of ammonia

2.2.3 有機(jī)氮存在下菌體對(duì)氨氮的降解情況

實(shí)際養(yǎng)殖體水體存在多種含氮有機(jī)物。本實(shí)驗(yàn)以胰蛋白胨作為含氮有機(jī)物代表，研究了菌體在復(fù)雜有機(jī)氮環(huán)境中的除氨氮能力。由圖4可知，胰蛋白胨質(zhì)量濃度在3.2～6.4 mg/L時(shí)，培養(yǎng)基中的氨氮沒(méi)有被去除，而且濃度高于初始值，這可能是高濃度的有機(jī)氮抑制了細(xì)菌對(duì)無(wú)機(jī)氮的吸收，同時(shí)細(xì)菌的氨化作用產(chǎn)生了更多的氨氮；在胰蛋白胨質(zhì)量濃度≤3.2 mg/L時(shí)，胰蛋白胨含量的增加對(duì)氨氮去除率有一定的影響，不過(guò)仍保持著較高的氨氮去除率。由此可知，在一定濃度的有機(jī)氮存在下，菌株B4仍能對(duì)水體中的氨氮進(jìn)行有效地去除，這有利于其在水產(chǎn)養(yǎng)殖中的應(yīng)用。

圖4 不同胰蛋白胨質(zhì)量濃度下氨氮的去除情況Fig.4 Removal of ammonia at different tryptoneconcentrations

2.3 菌株的高密度產(chǎn)芽孢發(fā)酵條件

2.3.1 發(fā)酵培養(yǎng)基的確定

考慮到芽孢桿菌產(chǎn)芽孢的共性，為提高優(yōu)化效率，以培養(yǎng)基1～6進(jìn)行初始發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選。結(jié)果如圖5所示。菌株在培養(yǎng)基6中，24 h發(fā)酵芽孢數(shù)最高為1.23×109CFU/mL，因此選定培養(yǎng)基6為初始發(fā)酵培養(yǎng)基。但是，培養(yǎng)基6發(fā)酵過(guò)程中，B4發(fā)酵后期出現(xiàn)大量菌體自溶現(xiàn)象，需要進(jìn)行進(jìn)一步優(yōu)化。

圖5 培養(yǎng)基1～6號(hào)發(fā)酵芽孢數(shù)Fig.5 Number of spores in 1-6 fermentation medium

發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比不當(dāng)，可能引起細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)快造成的菌體發(fā)酵后期自溶現(xiàn)象，導(dǎo)致一部分菌體無(wú)法形成芽孢，并且過(guò)高含量的碳氮源增加發(fā)酵成本，因此本實(shí)驗(yàn)選擇了較低的碳氮比(質(zhì)量比)進(jìn)行發(fā)酵優(yōu)化，結(jié)果見(jiàn)圖6所示。當(dāng)培養(yǎng)基中碳氮比為0.33和0.67時(shí)，發(fā)酵后期時(shí)因營(yíng)養(yǎng)不足，菌體出現(xiàn)大量自溶，最終無(wú)芽孢產(chǎn)生。當(dāng)培養(yǎng)基中碳氮比為1.32和2.64時(shí)，菌體發(fā)酵后期無(wú)自溶現(xiàn)象產(chǎn)生，分別用36 h的菌液進(jìn)行芽孢平計(jì)數(shù)，碳氮比為2.64時(shí)，芽孢數(shù)為1.54×109CFU/mL，芽孢率為70%；碳氮比為1.32時(shí)，芽孢數(shù)為2.3×109CFU/mL，芽孢率為95.7%，芽孢數(shù)是初始發(fā)酵培養(yǎng)基碳氮比未優(yōu)化之前的1.8倍，因此將發(fā)酵培養(yǎng)基的碳氮比定為1.32。

圖6 不同碳氮比對(duì)芽孢產(chǎn)生的影響Fig.6 Effect of different C/N on spore production

2.3.2 3 L發(fā)酵罐葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵

根據(jù)實(shí)驗(yàn)前期搖瓶發(fā)酵數(shù)據(jù)，發(fā)酵過(guò)程中碳源含量極大影響了菌株B4最終的發(fā)酵芽孢數(shù)，太低或太高都會(huì)影響細(xì)菌前期生長(zhǎng)速度，從而出現(xiàn)發(fā)酵后期菌體自溶而無(wú)法形成芽孢的現(xiàn)象，因此本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了罐上的葡萄糖補(bǔ)料控制。發(fā)酵過(guò)程中，未進(jìn)行補(bǔ)料時(shí)，發(fā)酵芽孢數(shù)最低為2.2×109CFU/mL(圖7-a)，以20 g/(L·h)葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料時(shí)，菌體在補(bǔ)料過(guò)程中濃度快速增加，待菌體濃度達(dá)到頂點(diǎn)后停止補(bǔ)料，這時(shí)菌體大量自溶，菌體濃度大幅降低，最終發(fā)酵芽孢數(shù)為5.62×109CFU/mL(圖7-c)；以10 g/(L·h)葡萄糖進(jìn)行補(bǔ)料時(shí)，菌體保持較平緩的增長(zhǎng)狀態(tài)，菌體濃度達(dá)到頂點(diǎn)后停止補(bǔ)料，菌體僅出現(xiàn)了發(fā)酵后期正常的少量自溶現(xiàn)象，最終發(fā)酵芽孢數(shù)為1.12×1010CFU/mL(圖7-b)，是未補(bǔ)料時(shí)芽孢數(shù)的5倍左右，為最高發(fā)酵芽孢數(shù)。

2.4 B4菌劑對(duì)模擬養(yǎng)殖水體中氨氮的降解

將上述產(chǎn)芽孢發(fā)酵液，與玉米芯粉混合干燥后制得菌劑，其中芽孢含量為2×1010CFU/g。我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)例表明，水體污染程度不同，其中所含無(wú)機(jī)氮的濃度也有差別[22]，因此模擬不同濃度氨氮水體進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果如圖8所示。

a-不補(bǔ)料;b-10 g/(L·h)葡萄糖補(bǔ)料；c-20 g/(L·h)葡萄糖補(bǔ)料圖7 葡萄糖補(bǔ)料發(fā)酵過(guò)程Fig.7 Glucose fed fermentation process

圖8 B4菌劑對(duì)模擬養(yǎng)殖水體中氨氮的降解Fig.8 Degradation of ammonia in simulated aquaculturewater by B4 microbiological agent

在1、10、20 mg/L的低質(zhì)量濃度氨氮的水體中，12 h菌劑的氨氮去除率可達(dá)100%，在50 mg/L高質(zhì)量濃度氨氮的水體中，12 h的菌劑的氨氮去除率為94%，平均去除率為3.92 mg/(L·h)，48 h后，氨氮質(zhì)量濃度略有回升，可能是因?yàn)榫w生長(zhǎng)后期自溶釋放了一部分氨氮。菌劑對(duì)模擬養(yǎng)殖水體中氨氮的快速去除表明它在實(shí)際應(yīng)用中具有良好潛力。

3 結(jié)論

以去除氨氮的能力為主要指標(biāo)，篩選出1株可用于快速去除養(yǎng)殖水體中氨氮的解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)B4，該菌株對(duì)100 mg/L氨氮以及50 mg/L亞硝酸鹽氮的去除率分別為92.32%和100%，通過(guò)優(yōu)化發(fā)酵條件，發(fā)酵產(chǎn)芽孢數(shù)達(dá)到1.12×1010CFU/mL，制得的菌劑用于1～50 mg/L不同氨氮質(zhì)量濃度的模擬養(yǎng)殖水體,12 h氨氮去除率達(dá) 94%以上。綜上所述，表明該菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有利用潛力。