濃香型窖泥原核微生物群落多樣性及其在窖池中的空間異質(zhì)性

胡曉龍，王康麗，余苗，田瑞杰，范海報(bào)，孫繼祥，張軍，楊旭，馬歌麗，魏濤*

1(鄭州輕工業(yè)大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州， 450000) 2(河南仰韶酒業(yè)有限公司，博士后創(chuàng)新實(shí)踐基地，河南 澠池， 472400) 3(河南皇溝酒業(yè)有限責(zé)任公司，河南 永城， 476600)

窖泥是我國(guó)特有的環(huán)境樣品，是一種富含多種有機(jī)物(脂肪酸、醇、酯等)，具有高腐殖質(zhì)含量、高含水量及低含氧量等特性的特殊土壤[1-3]，棲息著大量厭氧菌群，如乳酸菌、產(chǎn)己酸菌及產(chǎn)甲烷菌等。窖泥微生物菌群是影響窖泥和白酒質(zhì)量?jī)?yōu)劣的主要因素[4]，同時(shí)也是白酒釀造過(guò)程中重要的微生物來(lái)源，尤其是厭氧菌群[5]。

窖泥微生物的研究主要包括：(1)功能微生物分離及應(yīng)用等。如自1964年“茅臺(tái)試點(diǎn)”以來(lái)，有諸多關(guān)于己酸菌的研究，其中吳衍庸等[6]率先從窖泥中分離出多株己酸菌(如ClostridiumLushun)并成功應(yīng)用人工窖泥制備、窖泥養(yǎng)護(hù)等，大大縮短窖泥自然老熟時(shí)間及提升白酒品質(zhì)；近年來(lái)任聰?shù)萚7]通過(guò)差異性解析新老窖泥微生物菌群組成確定了窖泥中主體己酸菌為產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens)等；(2)群落多樣性解析。這主要是由于系統(tǒng)闡明濃香型窖泥中微生物群落α-及β-多樣性及其影響因素，對(duì)評(píng)估窖泥質(zhì)量和安全、揭示窖泥菌群代謝特征、控制和優(yōu)化群落結(jié)構(gòu)及深入探究其在白酒釀造過(guò)程中的發(fā)酵機(jī)制具有重要的理論及現(xiàn)實(shí)意義。由于高通量測(cè)序技術(shù)的廣泛應(yīng)用[8]，不同窖齡、質(zhì)量、地理位置及窖池空間位置窖泥菌群組成、優(yōu)勢(shì)菌及痕量微生物已逐漸清晰，而且明確了pH、有效磷、含水量等是影響窖泥微生物菌群組成的重要理化因子[2,4,9-10]。但有關(guān)我國(guó)北方濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)河南的窖泥微生物群落多樣性研究鮮有報(bào)道。鄭佳等[11]發(fā)現(xiàn)，窖泥香氣物質(zhì)含量與其所處窖池空間位置有關(guān)，如距窖口30 cm(上層)、120 cm(中層)、210 cm(下層)和240 cm(窖底)的窖泥香氣成分組成存在明顯的差異。TAO等[9]發(fā)現(xiàn)老窖池(≥25年)的窖底泥原核微生物群落趨于穩(wěn)定，但其中窖泥微生物群落的空間分布特征尚不清晰。

本文以河南某知名濃香型白酒企業(yè)的老窖池(35年)窖泥為研究對(duì)象，采用高通量測(cè)序技術(shù)全面解析窖壁上層、中層、下層和窖底窖泥原核微生物群落α-和β-多樣性；并基于冗余分析探究影響微生物菌群分布的理化因素，以期揭示窖泥原核微生物群落多樣性在老窖池中的空間異質(zhì)性及形成原因，為進(jìn)一步探究不同位置窖泥對(duì)濃香型白酒釀造及風(fēng)味物質(zhì)形成的具體影響和貢獻(xiàn)提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

窖泥樣品由河南某知名濃香型白酒企業(yè)提供；NaOH、酚酞、鄰苯二甲酸氫鉀、濃H2SO4、HCl、重鉻酸鉀、酒石酸鉀鈉、亞硝基鐵氰化鉀、高氯酸鈉、NH4Cl、酒石酸銻鉀、鉬酸銨、氟化銨、硼酸，均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV BlueStar A紫外分光光度計(jì)，北京萊伯泰科儀器股份有限公司；TGL-20M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PB-10 PH計(jì)，德國(guó)Sartorius公司；MP200A精密電子天平，上海良豐儀器儀表有限公司；101-1電熱鼓風(fēng)干燥箱，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；DF-1集熱式恒溫磁力攪拌鍋，金壇市中大儀器廠(chǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 窖泥樣品采集

對(duì)河南一家知名濃香型白酒企業(yè)的老窖池(35年)進(jìn)行取樣，該企業(yè)濃香型白酒生產(chǎn)以多糧(高粱、小麥、大米、糯米、玉米)為原料，中高溫大曲為糖化發(fā)酵劑，采用固定配醅比例入池，混蒸混燒、泥窖固態(tài)續(xù)茬發(fā)酵方式，分層蒸餾，分段摘酒，分級(jí)儲(chǔ)存。隨機(jī)選取2口窖池，每口窖池選取窖壁上層(PW-T，距窖口垂直距離約0.3 m)、中層(PW-M，窖壁中心)和下層(PW-U，距窖底垂直距離約0.3 m)，以及窖底(PB)窖泥取樣；每層選取2個(gè)(距每層中心兩側(cè)0.3 m處)窖泥樣品并混勻作為該層代表性樣品，窖底泥代表樣品為窖底平面對(duì)角線(xiàn)交界點(diǎn)處窖泥和任一條對(duì)角線(xiàn)的一個(gè)四分位點(diǎn)處窖泥的混合物。即每口老窖池共取4個(gè)代表樣品，共計(jì)8個(gè)窖泥樣品。將每份窖泥樣品分為2份于-20 ℃冰箱保存，1份用于理化性質(zhì)分析，另1份用于高通量分析。

1.3.2 理化指標(biāo)測(cè)定

參照李俊輝等[12]提出的烘干法和電位法分別測(cè)定窖泥含水量及pH。采用酸、堿中和滴定法測(cè)定總酸含量[13]。采用重鉻酸鉀氧化分光光度法測(cè)定乙醇含量[14]。采用靛酚藍(lán)比色法測(cè)定窖泥中氨態(tài)氮的含量[15]。參照NY/T 1121.7—2014行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定窖泥中有效磷含量。

1.3.3 窖泥宏基因組提取及 Illumina Miseq 測(cè)序

利用Magen HiPure Soil DNA Kit試劑盒并參照說(shuō)明書(shū)對(duì)窖泥樣品進(jìn)行總DNA提取，然后用Qubit 2.0熒光定量?jī)x測(cè)定其濃度和純度。將合格的DNA委托蘇州金唯智生物科技有限公司完成建庫(kù)及Illumina MiSeq雙端測(cè)序。其中16S rDNA擴(kuò)增子引物對(duì)為F：5’-CCTACGGRRBGCASCAGKVR VGAAT-3’和R：5’-GGACTACNVGGGTWTCTAATCC-3’，擴(kuò)增區(qū)域?yàn)?6S rDNA的V3-V4區(qū)。

1.3.4 數(shù)據(jù)分析

采用Cutadapt(v1.9.1)、Vsearch(v1.9.6)及Qiime(v1.9.1)軟件對(duì)高通量測(cè)序序列進(jìn)行質(zhì)控，包括序列拼接，以及去除含有 N 的序列、引物和接頭、質(zhì)量值<20的堿基、長(zhǎng)度<200 bp的序列及嵌合體序列得到有效序列。使用 VSEARCH(v1.9.6)將有效序列進(jìn)行聚類(lèi)，其中相似性≥97%的序列歸為1個(gè)OTU。然后利用 RDP classifier (ribosomal database program) 貝葉斯算法對(duì) OTU 的代表性序列進(jìn)行物種分類(lèi)學(xué)分析，并在不同物種分類(lèi)水平下統(tǒng)計(jì)每個(gè)樣本的群落組成。基于 OTU得到分析結(jié)果，采用對(duì)樣本序列進(jìn)行隨機(jī)抽平的方法，分別計(jì)算 Shannon、Chao1等α-多樣性指數(shù)反映群落的物種豐度和多樣性。采用軟件Canoco 5繪制RDA圖譜；SPSS 20軟件(IBM Corp., Armonk, NY)進(jìn)行單因素方差分析(ANOVA)；Venn圖采用在線(xiàn)軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制；Heml軟件繪制熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 窖泥樣品理化性質(zhì)

由表1可知，不同位置窖泥樣品的平均pH為5.43～8.66，與報(bào)道的正常窖泥及老窖泥的pH(5～7.61)具有一定的可比性，高于一般的新窖(1年)窖泥及退化窖泥(pH<4.5)[4,9,16-18]，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所取窖池與老窖及正常窖池特征相似。從空間位置分析，窖泥含水量(35.8%～45.3%)、乙醇(10.6～20.4 mg/g FPM)、總酸(3.5～5.2 mg/g FPM)及有效磷(147.3～348 mg/kg FPM)含量隨窖壁深度增加基本均呈上升趨勢(shì)，pH(5.4～5.9)與銨態(tài)氮含量(593.1～419.6 mg/kg FPM)變化趨勢(shì)與之相反。但除了銨態(tài)氮和有效磷外，上述理化性質(zhì)在窖壁不同位置的窖泥樣品中不存在顯著差異(P>0.05)。與窖壁泥相比，窖底泥中pH、有效磷和銨態(tài)氮含量較高，且前兩者顯著高于窖壁上層窖泥(P<0.05)。由于pH和有效磷與微生物群落α-多樣性呈正相關(guān)[4]，因此推測(cè)窖底泥原核微生物群落物種豐度及多樣性均應(yīng)高于窖壁上層窖泥。綜上，經(jīng)長(zhǎng)期發(fā)酵，不同位置窖泥樣品理化性質(zhì)呈現(xiàn)一定的差異，這種差異可能是由不同位置窖泥與空氣接觸頻次、與黃水接觸程度、持水性差異、微生物組成差異等因素造成的[2]。

表1 窖泥樣品的理化指標(biāo)Table 1 Physicochemical indexes of pit mud samples

注：FPM為新鮮窖泥；a,b代表不同位置窖泥樣品的理化性質(zhì)存在顯著性差異(P<0.05)

2.2 窖泥微生物群落α-多樣性

如圖1所示，當(dāng)測(cè)序深度超過(guò)1萬(wàn)條時(shí)，稀疏曲線(xiàn)進(jìn)入平臺(tái)期。由于本研究測(cè)序深度(≥43 276條)遠(yuǎn)大于1萬(wàn)條且覆蓋率均超過(guò)99%(表2)，說(shuō)明本次測(cè)序深度可覆蓋樣品中絕大多數(shù)微生物信息。

圖1 基于窖泥微生物群落Observed OTUs的稀疏曲線(xiàn)Fig.1 Rarefaction curves of pit mud microbialcommunity based on observed OTUs

由表2可知，上層窖泥物種豐度(Chao1指數(shù))及多樣性(Shannon指數(shù))均最低，窖底泥物種多樣性最高，但其物種豐度僅高于窖壁上層窖泥，中層和下層窖泥物種豐度較高，但其物種多樣性介于上層和窖底泥之間。對(duì)于窖壁泥來(lái)說(shuō)，中層窖泥的物種豐度和多樣性高于上層和下層窖泥。此外，窖底泥均高于窖壁上層窖泥原核微生物群落物種豐度及多樣性，這也與上述理化性質(zhì)分析的推測(cè)結(jié)果一致。但整體上，不同位置窖泥樣品微生物群落OTU數(shù)量(249～305)、物種豐度Chao1(298.6～339.7)及物種多樣性Shannon(2.98～3.69)無(wú)顯著差異(P>0.05)，表明正常老窖池不同位置窖泥原核微生物群落α-多樣性差異不顯著(P>0.05)。我們推測(cè)這種現(xiàn)象主要是與窖泥pH有關(guān)，由于pH是影響環(huán)境微生物群落α-多樣性(Chao1、Shannon等)的主要因素，在一定的pH范圍內(nèi)(3

表2 窖泥樣品原核微生物有效序列數(shù)、豐度及α-多樣性指數(shù)Table 2 Effective sequence number, abundance and α-diversity index of prokaryotic microorganisms in pit mud samples

2.3 窖泥微生物群落β-多樣性分析

基于窖泥樣品OTU組成的層次聚類(lèi)分析(hierarchical cluster analysis，圖2),將不同位置的窖泥劃分為2個(gè)簇，上層窖泥單獨(dú)聚為1簇(I)，其他3個(gè)位置的窖泥聚為另一簇(II)；第II簇又可以分為2個(gè)亞簇，下層窖泥和1個(gè)中層窖泥聚在第i亞簇，窖底泥和和另一個(gè)中層窖泥聚在第ii亞簇，表明窖池長(zhǎng)期使用后其窖泥微生物群落呈現(xiàn)出明顯的空間異質(zhì)性，其中上層窖泥微生物群落變化程度要快于其他位置的窖泥。這可能是由于窖壁上層含水量低及有效磷含量低有關(guān)(表1)，張會(huì)敏等[2]和HU等[4]研究結(jié)果表明其均能顯著影響窖泥微生物群落結(jié)構(gòu)。因此，進(jìn)一步解析不同位置窖泥微生物群落(門(mén)、綱、屬水平)組成及理化因子對(duì)其影響有助于深入揭示窖泥微生物群落的空間異質(zhì)性及其形成的理化原因。

圖2 不同位置窖泥樣品的層次聚類(lèi)分析Fig.2 Hierarchical cluster analysis of pit mudsamples in different locations

2.3.1 窖泥原核微生物門(mén)/綱水平組成

經(jīng)OTU注釋?zhuān)袠悠分泄矙z測(cè)到12個(gè)可鑒定門(mén)，包括11個(gè)細(xì)菌門(mén)及1個(gè)古菌門(mén)。如圖3-a所示，8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)(至少在2個(gè)樣品中含量均>1%的門(mén))占每個(gè)樣品總含量的98.9%～99.9%，除軟壁菌門(mén)(Tenericutes，0.99%)外，其余優(yōu)勢(shì)菌門(mén)平均含量均大于1%。其中平均含量>2%的優(yōu)勢(shì)門(mén)分別為厚壁菌門(mén)(Firmicutes，71.1%)、擬桿菌門(mén)(Bacteroidetes，16.3%)、互養(yǎng)菌門(mén)(Synergistetes，5%)和廣古菌門(mén)(Euryarchaeota，2.1%)，其常以?xún)?yōu)勢(shì)菌廣泛存在于四川[20]、安徽[21]和江蘇[4]產(chǎn)區(qū)的老窖泥、老熟窖泥或優(yōu)質(zhì)窖泥中。但本文窖泥中Euryarchaeota 的含量遠(yuǎn)低于已報(bào)道的四川、安徽和江蘇產(chǎn)區(qū)的老窖泥或優(yōu)質(zhì)窖泥樣品(8.7%～27.6%)[4,9,21]，這可能是由窖泥的綜合理化性質(zhì)差異造成的，如該酒企的銨態(tài)氮或有效磷含量低于上述窖泥，其中銨態(tài)氮含量遠(yuǎn)低于上述四川(≥3.55 g/kg)和安徽窖泥(≥2.96 g/kg)，而其有效磷含量明顯低于上述優(yōu)質(zhì)窖泥(805 mg/kg)，而這些理化因子含量與窖泥中Euryarchaeota含量呈極顯著的正相關(guān)[4,9]。Tenericutes在近老熟的窖泥中含量較高[22]，放線(xiàn)菌門(mén)(Actinobacteria)在老窖泥含量(50年，1.09%～7.58%)及類(lèi)群(67個(gè)OTUs)均較新窖(1年和5年窖齡，0.34%～0.97%，54個(gè)OTUs)高或多[9,23]。Cloacimonetes為個(gè)別酒企老窖泥(25年)中的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。此外，Proteobacteria為新窖或退化窖泥優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，在本文所用窖泥中的含量均很低(0.24%)。上述結(jié)果再次表明本文供試窖泥微生物群落組成特征與上述老窖泥相似。此外，目前Patescibacteria門(mén)在其他濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)窖泥中鮮有報(bào)道，推測(cè)其可能為該酒企特有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。

從空間分布來(lái)看，隨窖池深度增加，F(xiàn)irmicutes呈下降趨勢(shì)，其中PW-T窖泥Firmicutes(90.6%)顯著高于PB(54.4%，P<0.05)。Bacteroidetes和Tenericutes門(mén)呈波動(dòng)趨勢(shì)，在PW-M和PB中含量較高，但無(wú)顯著差異。Synergistetes和Actinobacteria呈先升后降趨勢(shì)，在PW-U中含量最高，分別為11.8%和3%，并分別顯著高于PW-T中的Synergistetes及PB中的Actinobacteria含量。Euryarchaeota和Patescibacteria呈上升趨勢(shì)，且PW-T中Euryarchaeota顯著低于其他層次的窖泥。較之于窖壁泥(0.1%～0.2%)，Cloacimonetes主要存在于PB中(6.4%)。

在綱水平，共20個(gè)可鑒定綱，10個(gè)優(yōu)勢(shì)綱(至少在2個(gè)樣品中含量均>1%的綱，圖3-b)。含量超過(guò)2%的優(yōu)勢(shì)綱分別為梭菌綱(Clostridia，68.3%)、擬桿菌綱(Bacteroidia，16.3%)、互養(yǎng)菌綱(Synergistia，5%)和芽孢桿菌綱(Bacilli，2.3%)，占每個(gè)樣品的79.3%～97.6%，其中前2個(gè)綱是老窖泥、正常窖泥或優(yōu)質(zhì)窖泥中的含量較高的優(yōu)勢(shì)菌綱[4,9]。從空間位置來(lái)看，優(yōu)勢(shì)菌綱的分布情況與其對(duì)應(yīng)門(mén)分布情況基本一致(圖3-a和3-b)，如Clostridia和Bacilli的變化規(guī)律與其對(duì)應(yīng)的Firmicutes一致，呈下降趨勢(shì)；Bacteroidia(屬Bacteroidetes門(mén))呈波動(dòng)趨勢(shì)；Synergistia(屬Synergistetes門(mén))呈先升后降趨勢(shì)且在PW-U中含量最高等。

2.3.2 窖泥原核微生物屬水平組成

共檢測(cè)到142個(gè)屬，其中上層窖泥屬數(shù)量最少(92個(gè))，中層最高(120個(gè))，下層(106個(gè))和窖底泥(110個(gè))介于兩者之間，與表2中OTU變化規(guī)律一致。Venn圖顯示特有屬數(shù)量在中層窖泥最多(17個(gè)，占總的50%)，但其在每類(lèi)窖泥中的含量均很低(0.03%～0.2%，圖4)。不同位置窖泥共有屬數(shù)量共75個(gè)，每類(lèi)樣品中含量均為98%左右，表明共有屬可能是老窖池窖泥中的重要微生物類(lèi)群，其總含量不受空間位置影響。

a-門(mén)水平；b-綱水平圖3 窖泥原核微生物門(mén)和綱水平組成Fig.3 Composition of prokaryotic microorganisms in pit mudat the level of phylum and class注：“*”表示不同位置窖泥存在顯著差異(P<0.05)

圖4 屬水平Venn圖Fig.4 Venn diagram of microbial flora at genus level

將每個(gè)樣品中含量≥1%的屬定義為優(yōu)勢(shì)屬，共32個(gè)(圖5)，占每個(gè)樣品的83.3%～93.4%，包括24個(gè)可鑒定屬(71.8%)及8個(gè)未鑒定屬(17.5%)，表明該企業(yè)窖泥中可能蘊(yùn)含著較豐富的特有微生物資源，菌群復(fù)雜[2]。優(yōu)勢(shì)菌屬隸屬于9個(gè)綱，主要集中在Clostridia(19個(gè)屬，總含量為61.4%)、Bacteroidia(6個(gè)屬，占16.0%)，其中12個(gè)屬在所有樣品中的平均含量≥2%(圖5中標(biāo)記“**”的屬)，產(chǎn)己酸菌屬(Caproiciproducens，27.3%)最高，其次為Proteiniphilum(9.9%)。Caproiciproducens是我國(guó)濃香型白酒其他主產(chǎn)區(qū)(四川、安徽)老窖泥或正常窖泥的優(yōu)勢(shì)菌屬[7,16,21 ]；但乳桿菌屬(Lactobacillus)含量(2.3%)遠(yuǎn)低于已報(bào)道的新窖(62.3%)和退化窖泥(91.5%)[4,9]，再次說(shuō)明本研究供試窖池為正常老窖池。

熱圖進(jìn)一步展示了32個(gè)窖泥優(yōu)勢(shì)屬空間分布差異(圖5)，其中上層窖泥含量最高的屬有10個(gè)、中層2個(gè)、下層6個(gè)和窖底14個(gè)。例如，上層窖泥中Caproiciproducens(45.6%)、氫孢菌屬(Hydrogenispora，5.5%)和Lactobacillus(6.1%)平均含量最高，其中Caproiciproducens屬隨窖池深度增加呈逐漸下降趨勢(shì)，Lactobacillus窖底泥含量最低。Fastidiosipila屬含量下層>窖底>中層>上層。沉積菌屬(Sedimentibacter)和互營(yíng)單胞菌屬(Syntrophomonas)窖底泥含量>任何窖壁泥。甲烷短桿菌(Methanobrevibacter)和氨基桿菌屬(Aminobacterium)含量下層>中層>窖底>上層。發(fā)酵單胞菌屬(Fermentimonas)含量中層>下層>窖底>上層窖泥，等等。

圖5 基于優(yōu)勢(shì)屬的熱圖分析Fig.5 Heatmap analysis based on dominant genera注：“**”表示含量≥2%的屬

綜上，窖泥微生物群落組成存在明顯的空間異質(zhì)性，整體來(lái)說(shuō)75%優(yōu)勢(shì)屬的含量在上層或窖底窖泥中最高；且相同位置窖泥之間也存在一定的差異(如2個(gè)PB樣品中Proteiniphilum含量差異較大等)。與之前關(guān)于不同位置(僅選2個(gè)位置，窖壁和窖底)窖泥的研究相比[2]，本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)系統(tǒng)地解析了窖壁上層、中層、下層及窖底泥4個(gè)位置窖泥微生群落多樣性，有助于揭示窖泥微生物群落在老窖池中的空間分布規(guī)律。同時(shí)為不同位置窖泥的定向微生物強(qiáng)化，以及特有窖泥微生物資源的開(kāi)發(fā)提供一定的理論依據(jù)，如從富含未鑒定屬(Clostridiaceae_1_Un)的PW-U中篩選新的種屬。

如前所述，窖泥是一個(gè)以兼性(如Lactobacillus)和專(zhuān)性(如Clostridia綱中的屬)厭氧微生物為主要菌群的特殊且復(fù)雜的微生態(tài)體系[1,4]，且存在大量未知種屬。這種原核微生物群落復(fù)雜性和多樣性是窖泥菌群功能多樣性和魯棒性(指生物體抵抗外界擾動(dòng)或自體內(nèi)部攝動(dòng)的能力)的基礎(chǔ)。例如，Clostridia綱中Clostridiumspp.(ClusterI)能利用多種底物(簡(jiǎn)單或復(fù)雜碳源、蛋白質(zhì)等)合成多種不同碳鏈長(zhǎng)度脂肪酸(己酸、乙酸、丁酸和辛酸等)、醇類(lèi)(己醇、丁醇和乙醇等)及CO2和H2等氣體，其中己酸衍生物(己酸乙酯)是濃香型白酒主體香，該屬是窖泥中較易篩選到的梭菌[8,24-26]，如C.kluyveri、C.carboxidivorans、C.sporogenes和C.tyrobutyricum等。Syntrophomonas屬(Clostridia：ClusterVIII)能將長(zhǎng)鏈脂肪酸降解為乙酸和H2，可為氫或乙酸營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌提供底物[8-9]。Synergistia綱中的Aminobacterium屬能發(fā)酵氨基酸，如Aminobacteriumcolombiensegen能利用多種氨基酸(甘氨酸、絲氨酸等)，且與氫營(yíng)養(yǎng)型甲烷菌共生時(shí)氨基酸底物譜擴(kuò)大[27]；其代謝物銨態(tài)氮可為其他微生物生長(zhǎng)繁殖提供氮源[2]。Sedimentibacter屬能將硫代硫酸鹽和元素硫還原為硫化物[28]。Bacteroidia 綱中的屬(如Proteiniphilum、Petrimonas和Fermentimonas等)能水解多糖、蛋白質(zhì)及發(fā)酵糖類(lèi)生產(chǎn)乙酸和丙酸等脂肪酸，是一類(lèi)生物質(zhì)厭氧消化的重要微生物類(lèi)群[29]。此外，HU等[4]通過(guò)同現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析展示出窖泥不同微生物之間存在顯著正相關(guān)性，且Clostridia、Bacteroidia、Methanobacteria、Methanomicrobia及Synergistia等綱中的屬為窖泥復(fù)雜菌群網(wǎng)絡(luò)中的主要樞紐，其存在代謝關(guān)聯(lián)性。WANG等[5]通過(guò)微生物溯源(Source Tracker)分析發(fā)現(xiàn)酒醅原核菌群的14%來(lái)源于窖泥厭氧菌，如Petrimonas、Sedimentibacter和Syntrophomonas等屬。綜上，窖泥中微生物主要有4大主要功能：(1)窖泥微生物的高底物多樣性使其具有促進(jìn)窖泥中的物質(zhì)(碳源、氮源及硫元素等)循環(huán)的能力；(2)窖泥微生物群落的復(fù)雜性(多樣性高)及其代謝關(guān)聯(lián)性有助于增強(qiáng)窖泥菌群的魯棒性及其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性；(3)為發(fā)酵過(guò)程中的酒醅提供重要的厭氧微生物菌群；(4)可為濃香型白酒提供重要的呈香物質(zhì)或其前體物質(zhì)(己酸、丁酸、辛酸及其相應(yīng)乙酯等)，如Clostridia類(lèi)群的代謝物。

2.4 窖泥理化因子與微生物群落的冗余分析(redundancy analysis, RDA)

窖泥理化因子是影響微生物群落α-及β-多樣性的重要因素[4,22]。冗余分析將32個(gè)優(yōu)勢(shì)屬大致分為4個(gè)類(lèi)群(圖6-a陰影區(qū)域)，每個(gè)類(lèi)群對(duì)應(yīng)一類(lèi)位置的窖泥(圖6-b)。結(jié)合熱圖分析(圖5)發(fā)現(xiàn)每個(gè)類(lèi)群在其對(duì)應(yīng)窖泥中的含量最高，例如圖6-a左上陰影區(qū)域的10個(gè)屬的含量均在PW-T中最高，右側(cè)陰影區(qū)域14個(gè)屬的含量均在PB中最高。窖泥因子對(duì)優(yōu)勢(shì)屬菌群結(jié)構(gòu)的總解釋貢獻(xiàn)度為71.4%(圖6-a和6-b)，其中Axis1軸占43.3%，可將窖壁泥和窖底泥較好地區(qū)分開(kāi)；Axis2軸占28.0%能將窖壁泥(PW-T、PW-M和PW-U)區(qū)分開(kāi)。但對(duì)優(yōu)勢(shì)屬菌群結(jié)構(gòu)的影響是多個(gè)理化因子的綜合作用，如PB與pH、有效磷和銨態(tài)氮呈正相關(guān)，與乙醇和總酸呈負(fù)相關(guān)；PW-T與多種理化因子呈負(fù)相關(guān)，尤其是含水量和有效磷等(圖6-b)。

a-優(yōu)勢(shì)屬;b-樣品圖6 基于冗余分析的環(huán)境因子分別與優(yōu)勢(shì)屬及樣品關(guān)系圖Fig.6 The relationship between environmental factors anddominant genera and samples based onredundancy analysis

條件限制分析(conditional term effects)揭示了每個(gè)理化因子對(duì)優(yōu)勢(shì)屬菌群結(jié)構(gòu)影響程度，其中pH(33.8%)和有效磷(20.1%)對(duì)菌群影響較大，然后依次為總酸(13.5%)>銨態(tài)氮(12.6%)>含水量(10.4%)，乙醇影響最小(6.3%)，且只有pH值與優(yōu)勢(shì)屬菌群結(jié)構(gòu)呈極顯著相關(guān)(P<0.01)，而其他因子均不顯著(P>0.05)。此外，相關(guān)研究表明pH、有效磷或銨態(tài)氮與老、優(yōu)質(zhì)窖泥呈顯著正相關(guān)，與退化窖泥呈顯著負(fù)相關(guān)[4,9]。綜上，pH、有效磷或銨態(tài)氮不僅是影響窖泥微生物菌群在不同窖齡和質(zhì)量窖泥中分布的主要理化因子，在一定程度還影響著其在正常老窖池中的空間分布，尤其是pH。

3 結(jié)論

河南作為我國(guó)濃香型白酒主產(chǎn)區(qū)之一，但關(guān)于其窖泥微生物群落α-及β-多樣性及其窖池空間異質(zhì)性研究鮮有報(bào)道。結(jié)合理化因子分析，本文對(duì)河南某濃香型白酒企業(yè)老窖池(35年)4個(gè)不同位置(窖壁上、中、下層和窖底)窖泥原核微生物群落多樣性進(jìn)行了解析，結(jié)果均表明供試窖池特征與老窖池相似。群落α-多樣性(Chao1和Shannon)分析表明不同位置窖泥之間存在差異但不顯著(P>0.05)。該酒企老窖泥中共8個(gè)優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，主要為Firmicutes(71.1%)和Bacteroidetes(16.3%)，并推測(cè)Patescibacteria可能為河南產(chǎn)區(qū)或該酒企特有的優(yōu)勢(shì)菌門(mén)。32個(gè)優(yōu)勢(shì)屬隸屬于9個(gè)綱，主要集中在Clostridia和Bacteroidia綱，其中Caproiciproducens屬含量最高。群落β-多樣性分析、層次聚類(lèi)分析及Venn分析表明窖泥原核微生物群落組成具有明顯的空間異質(zhì)性。例如，4個(gè)菌門(mén)的含量在窖池空間分布存在顯著差異且75%優(yōu)勢(shì)屬的含量在上層或窖底窖泥中含量最高；窖泥微生物群落呈現(xiàn)出明顯的窖池空間異質(zhì)性，其中上層窖泥微生物群落變化程度要快于其他位置的窖泥；中層窖泥特有屬數(shù)量(17個(gè))最多但含量很低(0.2%)等。RDA分析顯示pH和有效磷與窖泥菌群的相關(guān)性的解釋度最高，表明兩者可能是影響窖泥微生物群落窖池空間分布的主要理化因素。